تؤدي المبيدات دورًا حاسمًا في معالجة النقص العالمي في الغذاء ومكافحة الأمراض المنقولة بالنواقل. مع ذلك، تتطلب مشكلة مقاومة المبيدات المتفاقمة اكتشاف مركبات جديدة تستهدف مواقع غير مستغلة بشكل كافٍ. يمكن لقنوات مستقبلات الجهد العابر (TRPV) في الحشرات - نانتشونغ (Nan) وغير النشطة (Iav) - أن تُشكّل قنوات غير متجانسة (Nan-Iav) وتتمركز في الأعضاء الحسية الميكانيكية المسؤولة عن الانتحاء الأرضي والسمع والإحساس بالوضع في الحشرات. تستهدف بعض المبيدات، مثل أفيدوبيرولدون (AP)، قناة Nan-Iav عبر آليات غير معروفة. يُعدّ AP فعالًا ضد الحشرات الثاقبة الماصة (نصفية الأجنحة)، إذ يمنع تغذيتها عن طريق تعطيل وظيفة الخيوط. يرتبط AP فقط بقناة Nan، ولكن قناة Nan-Iav فقط هي التي تتفاعل مع المُنشّطات، بما في ذلك النيكوتيناميد الداخلي (NAM)، وبالتالي تُظهر نشاط القناة. على الرغم من إمكانات بروتين Nan-Iav كهدف محتمل للمبيدات الحشرية، إلا أن المعلومات المتوفرة حول تركيب قنواته، ومواقع ارتباطه التنظيمية، وتنظيمه المعتمد على أيونات الكالسيوم (Ca2+) لا تزال محدودة، مما يعيق تطوير المزيد من المبيدات الحشرية. في هذه الدراسة، استُخدم المجهر الإلكتروني فائق البرودة لتحديد بنية بروتين Nan-Iav في حشرات رتبة نصفيات الأجنحة في حالته الخالية من ربيطة الكالمودولين، وكذلك مع وجود AP وNAM عند حدود نطاق السيتوبلازم المتكرر للأنكيرين (ARD). والمثير للدهشة أننا وجدنا أن بروتين Nan نفسه قادر على تكوين خماسي، يتم تثبيته بواسطة تفاعلات ARD التي تتوسطها AP. تكشف هذه الدراسة عن التفاعلات الجزيئية بين المبيدات الحشرية والمنشطات وبروتين Nan-Iav، مما يُبرز أهمية نطاق ARD في وظيفة القناة وتكوينها، ويستكشف آلية تنظيم أيونات الكالسيوم (Ca2+).
في ظل تفاقم تغير المناخ العالمي، يُعد تدهور الأمن الغذائي العالمي أحد التحديات الرئيسية في القرن الحادي والعشرين، مع ما يترتب على ذلك من عواقب وخيمة على المجتمع.1,2ويقدر تقرير منظمة الصحة العالمية عن حالة الأمن الغذائي والتغذية في العالم لعام 2023 (SOFI) أن حوالي 2.33 مليار شخص في جميع أنحاء العالم يعانون من انعدام الأمن الغذائي المعتدل إلى الشديد، وهي مشكلة طويلة الأمد.3.4لسوء الحظ، تشير التقديرات إلى أن ما بين 20% إلى 30% أو أكثر من غلة المحاصيل تُفقد سنوياً بسبب الآفات ومسببات الأمراض، ومن المتوقع أن يؤدي الاحتباس الحراري إلى تفاقم مقاومة الآفات وضعف المحاصيل.4، 5، 6، 7، 8يُعد تطوير المبيدات أمرًا بالغ الأهمية ليس فقط لحماية المحاصيل من الآفات والحد من انتشار مسببات الأمراض المنقولة بالنواقل، ولكن أيضًا لمكافحة الأمراض البشرية المنقولة بالنواقل مثل حمى الضنك والملاريا وداء شاغاس، والتي أصبحت مقاومة للمبيدات بشكل متزايد.5، 9، 10، 11
من بين الأهداف الرئيسية للمبيدات الحشرية العصبية السامة، تمثل قناة TRPV غير المتجانسة رباعية الوحدات Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) فئة من أهداف المبيدات الحشرية التي تم اكتشافها فقط في العقد الماضي، بما في ذلك المبيدات الحشرية المتوفرة تجاريًا مثل imidacloprid و pyraclostrobin.12، 13، 14إن مبيد الحشرات شبه الاصطناعي أفيدوبيروليفين (AP) هو منتج تم تطويره وتسويقه مؤخرًا، ومكونه الرئيسي هو مبيد الحشرات النشط إنسكاليس®، الذي يرتبط بـ AP عند مستوى نشاط دون النانومولار.15يُظهر AP سمية حادة منخفضة للملقحات والحشرات المفيدة والكائنات الحية الأخرى غير المستهدفة، وعند استخدامه وفقًا لتعليمات الملصق، فإنه يمكن أن يقلل من ضغط المقاومة للمبيدات الحشرية الأخرى.16، 17، 18تنتشر جينات Nan و Iav على نطاق واسع عبر أنواع الحشرات، ويتم التعبير عنها بشكل مشترك فقط في الخلايا العصبية الحسية للتمدد في قرون الاستشعار والأطراف، وهي ضرورية للسمع وإدراك الجاذبية والإحساس بالوضع.13، 16، 19، 20، 21، 22يحفز كل من AP و imidacloprid و pyraclostrobin مركب Nan-Iav من خلال آلية فريدة، مما يؤدي في النهاية إلى تثبيط نقل الإشارة الحسية.13، 16، 23في الحشرات الثاقبة الماصة (نصفية الأجنحة) مثل حشرات المن والذباب الأبيض، يؤدي فقدان الإحساس بالوضع إلى إضعاف قدرتها على التغذية، مما يؤدي في النهاية إلى الموت.13,24ومن المثير للاهتمام أن البروتين AP يُظهر انجذابًا عاليًا لمركب Nan-Iav وانجذابًا منخفضًا لـ Nan وحده. يؤدي ارتباط AP بـ Nan-Iav إلى توليد تيار كهربائي، لكن ارتباطه بـ Nan وحده لا يحفز نشاط القناة. أما Iav نفسه فلا يرتبط بـ AP على الإطلاق.16يشير هذا إلى أن بروتيني Nan وIav قد يرتبطان لتكوين معقدات قنوات Nan-Iav مختلفة (على سبيل المثال، بنسب قياسية مختلفة أو ترتيبات مختلفة ضمن نفس النسبة القياسية)، أو أن AP قد يرتبط بمواقع متعددة. علاوة على ذلك، يرتبط النيكوتيناميد (NAM)، وهو ناهض طبيعي، ببروتين Nan-Iav في ذبابة الفاكهة بتقارب ميكرومولي، مُظهِرًا تأثيرات مشابهة لتلك التي يُحدثها المن (AP) في المختبر.16.25وتثبيط تكاثر حشرات المن وتغذيتها، مما يؤدي في النهاية إلى موتها.25،26تثير هذه البيانات العديد من التساؤلات. فعلى سبيل المثال، لا يزال من غير الواضح كيف يتشكل ثنائي Nan-Iav غير المتجانس، وما هي مواقع الارتباط المستخدمة لتعديل الجزيئات الصغيرة، وكيف تنظم هذه الجزيئات الصغيرة وظيفة القناة عن طريق تثبيط الإحساس العميق. علاوة على ذلك، لا تزال أسباب كون Nan نفسه غير نشط وذو ألفة منخفضة لـ AP، بينما يكون ثنائي Nan-Iav غير المتجانس نشطًا ويرتبط بـ AP بألفة أعلى، غير واضحة. وأخيرًا، لا يُعرف إلا القليل عن تنظيم وظيفة Nan-Iav المعتمد على Ca2+ وكيفية دمجه في عمليات الإشارات العصبية.13,21
في هذه الدراسة، وباستخدام تقنيات المجهر الإلكتروني فائق البرودة، وعلم وظائف الأعضاء الكهربائية، وربط الليجاندات المشعة، كشفنا عن آلية تجميع بروتين Nan-Iav وآلية ارتباطه بمنظمات الجزيئات الصغيرة. علاوة على ذلك، رصدنا ارتباط الكالمودولين (CaM) بشكل دائم ببروتين Iav وخماسيات Nan المستقرة بواسطة AP. تُقدم هذه النتائج رؤى مهمة حول تنظيم أيونات الكالسيوم في القنوات، وتجميع القنوات، والعوامل التي تحدد ألفة ارتباط الليجاند. والأهم من ذلك، أكدنا أن ARD يلعب دورًا محوريًا في هذه العمليات. دراستنا لقنوات الحشرات الكاملة المرتبطة بمبيدات الآفات الزراعية ذات الصلة27، 28، 29يفتح آفاقًا لتطوير صناعة المبيدات، وتحسين فعالية المبيدات وخصوصيتها، وتمكين تطبيق المركبات التي تستهدف فيروس TRPV على أنواع أخرى لمعالجة الأمن الغذائي العالمي وانتشار الأمراض المنقولة بالنواقل.
وجدنا أيضًا أن قناة Nav-Iav تُنظَّم بواسطة أيونات الكالسيوم (Ca2+)، وأن آلية التنظيم تتم عبر ارتباط الكالمودولين (CaM) بها بشكل دائم. ومن المهم ذكره أن هذا التنظيم المعتمد على الكالسيوم لقناة Nav بواسطة الكالمودولين يختلف اختلافًا كبيرًا عن آليات تنظيم قنوات الأيونات الأخرى (مثل قنوات الصوديوم ذات البوابات الفولتية وقنوات TRPV5/6).52، 53، 54، 55، 56، 57في قناة Nav1.2، يرتبط النطاق الطرفي الكربوكسيلي للكالمودولين (CaM) حلزونيًا بالنطاق الطرفي الكربوكسيلي (CTD)، ويحفز أيون الكالسيوم (Ca2+) ارتباط نطاقه الطرفي الأميني بالجزء البعيد من النطاق الطرفي الكربوكسيلي (CTD).56في قناة TRPV5/6، يرتبط النطاق الطرفي الكربوكسيلي لبروتين الكالمودولين (CaM) ببروتين CTH، ويحفز أيون الكالسيوم (Ca2+) امتداد نطاقه الطرفي الأميني (N-terminal) إلى أعلى داخل المسام، مما يؤدي إلى منع نفاذية الكاتيونات.53,54نقترح نموذجًا لوظيفة Nan-Iav-CaM المنظمة بواسطة أيونات الكالسيوم (Ca2+) (الشكل 4ح). في هذا النموذج، يرتبط النطاق الطرفي الأميني (N-terminal) للكالمودولين (CaM) بشكل دائم بالنطاق الطرفي الكربوكسيلي (CTH) لبروتين Iav. في حالة الراحة (تركيز منخفض لأيونات الكالسيوم)، يتفاعل النطاق الطرفي الكربوكسيلي للكالمودولين مع Nan، مما يُثبّت بنية ARD وبالتالي يُعزز فتح القناة. يؤدي ارتباط مُنشّط/مبيد حشري بالقناة إلى فتح المسام، مما يؤدي إلى تدفق أيونات الكالسيوم. ثم يرتبط الكالسيوم بالكالمودولين، مما يُسبب انفصال النطاق الطرفي الكربوكسيلي عن نطاق ARD الخاص بـ Nan. ولأن منع ارتباط الكالسيوم يُلغي فعليًا التأثير المُثبّط للكالسيوم، فإن هذا الانفصال يُعدّل حركة نطاق ARD، مما يُسبب تثبيطًا أو إزالة حساسية تعتمد على الكالسيوم. يشير التعافي السريع لتيارات القناة بعد إطلاق أيونات الكالسيوم (الشكل 4g) إلى أن هذه الآلية تُسهّل الاستجابات السريعة للإشارات العصبية التي تتوسطها أيونات الكالسيوم. علاوة على ذلك، فقد أُفيد أن المنطقة الطرفية C من Iav، التي لا تزال غير مفهومة جيدًا، تلعب أدوارًا أخرى في توجيه القناة وتنظيم التيار.21
أخيرًا، تُقدّم دراستنا بنية عالية الدقة لمركب قناة TRP لمبيد حشري ذي أهمية زراعية، وهو اكتشاف لم نكن نعرفه من قبل. والجدير بالذكر أننا قمنا بتوصيف بنية ووظيفة قناة الحشرات في خلايا بشرية (HEK293S GnTi–) بدلًا من خلايا الحشرات. في ظل تزايد مقاومة الحشرات للمبيدات الحشرية والضغط المستمر على الأمن الغذائي وانتشار مسببات الأمراض، يُقدّم عملنا معلومات هامة تُسهّل تطوير مبيدات حشرية جديدة تُفيد صحة الإنسان والأمن الغذائي العالمي. وقد أظهرت الدراسات أن مبيدات حشرية مثل AP فعّالة ضد بعض الآفات عند استخدامها وفقًا لتعليمات الاستخدام، ولها سمية حادة منخفضة على الملقحات المفيدة، مما يُثبت سلامتها البيئية.13,16علاوة على ذلك، أظهرت اختبارات بعض مشتقات AP على البعوض أنها تفقد قدرتها على الطيران في نهاية المطاف. إن فهم كيفية ارتباط هذه المركبات المعدلة بـ Nan-Iav سيسهل تعديل المركبات الموجودة أو تطوير مركبات جديدة أكثر فعالية.دقيقمكافحة الآفات. تُظهر دراستنا أن واجهة Nan-Iav ARD بالغة الأهمية ليس فقط لتنظيم نشاط المركبات الداخلية والمبيدات الحشرية وCa2+-CaM، بل أيضًا لتكوين القناة. نقترح أن تعطيل تكوين ثنائي الوحدات غير المتجانسة باستخدام جزيئات صغيرة قد يكون نهجًا فريدًا وواعدًا لتطوير مثبطات قنوات الأيونات.
من بين الجينات الثمانية المتماثلة، تم اختيار الجينات كاملة الطول للخنفساء البنية (Halyomorpha halys) Nanchung وInactive، نظرًا لثباتها الممتاز في وجود المنظفات. تم تحسين الشفرة الوراثية للجينات المُصنّعة للتعبير البشري، ثم تم استنساخها في ناقل pBacMam pCMV-DEST (شركة Life Technologies) باستخدام مواقع التقييد XhoI وEcoRI. هذا يضمن أن تكون النسخ المستنسخة متوافقة مع علامات GFP-FLAG-10xHis وmCherry-FLAG-10xHis الطرفية، والتي يتم فصلها بواسطة بروتياز HRC-3C (PPX)، مما يسمح بالتعبير المستقل.تعبيركانت البادئات المستخدمة لاستنساخ نانتشونغ وغير النشط في ناقل pBacMam كما يلي:
تم الحصول على صور مجهرية لجزيئات منفردة باستخدام مجهر إلكتروني نافذ من نوع Titan Krios G2 (FEI) مزود بكاميرا K3 ومرشح طاقة Gatan BioQuantum. تم تشغيل المجهر عند طاقة 300 كيلو إلكترون فولت، مع ضبط طاقة 20 إلكترون فولت، وحجم بكسل للعينة 1.08 أنغستروم/بكسل (تكبير اسمي 81000 مرة)، وتدرج عدم تركيز يتراوح من -0.8 إلى -2.2 ميكرومتر. تم تسجيل الفيديو بمعدل 40 إطارًا في الثانية باستخدام مجهر Latitude S (Gatan) بمعدل جرعة اسمي 25 إلكترون/بكسل/ثانية، وزمن تعريض 2.4 ثانية، وجرعة إجمالية تقارب 60 إلكترون/أنغستروم².
تم تصحيح الحركة الناتجة عن الشعاع وترجيح الجرعة على الفيلم باستخدام برنامج MotionCor2 في RELION 4.061. وتم تقدير معلمات دالة نقل التباين (CTF) في برنامج cryoSPARC باستخدام طريقة تقدير CTF القائمة على الرقع62. واستُبعدت الصور المجهرية ذات دقة مطابقة CTF ≥ 4 أنغستروم من التحليل اللاحق. عادةً، استُخدمت مجموعة فرعية من 500 إلى 1000 صورة مجهرية لاختيار النقاط في cryoSPARC، تلتها عدة جولات من التصنيف ثنائي الأبعاد بعد الترشيح للحصول على صورة مرجعية واضحة لاختيار الجسيمات بناءً على القالب. ثم استُخرجت الجسيمات باستخدام مربعات إحاطة بحجم 64 بكسل وتجميع رباعي. وأُجريت عدة جولات من التصنيف ثنائي الأبعاد لإزالة فئات الجسيمات غير المرغوب فيها. أُعيد بناء النموذج ثلاثي الأبعاد الأولي باستخدام إعادة البناء من الصفر، وتم تحسينه باستخدام التحسين غير المنتظم في cryoSPARC. أُجري تصنيف ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامجي cryoSPARC أو RELION بناءً على عدم تجانس ARD. لم يُلاحظ أي تباين ملحوظ في نطاقات الغشاء. جرى تحسين الجسيمات باستخدام طريقتي C1 وC2؛ واعتُبرت الجسيمات ذات دقة C2 الأعلى متناظرة بالنسبة لـ C2، ثم استُوردت إلى RELION لإجراء تحسين بايزي. بعد ذلك، نُقلت الجسيمات مرة أخرى إلى cryoSPARC لإجراء تحسين نهائي غير منتظم وموضعي. يوضح الجدول 1 الدقة النهائية وعدد الجسيمات.
أثناء معالجة خماسيات Nan+AP، استكشفنا طرقًا مختلفة لتحسين دقة نطاقات الغشاء (وخاصة منطقة المسام)، مثل طرح الإشارة وإخفاء نطاق الغشاء العابر (TMD). إلا أن هذه المحاولات باءت بالفشل نظرًا للاضطراب الشديد المحتمل في منطقة المسام وعدم تجانس نطاق الغشاء العابر بشكل عام. حُسبت الدقة النهائية باستخدام قناع تم إنشاؤه تلقائيًا بواسطة طريقة المعالجة غير المنتظمة في cryoSPARC، مستهدفًا بشكل أساسي منطقة ARD. وقد حقق هذا دقة أعلى بكثير من دقة نطاقات الغشاء (وخاصة منطقة VSLD).
تم إنشاء نماذج أولية جديدة لأشكال البروتين Nanchung وInactive باستخدام برنامج Coot63، ثم تم إنشاء نماذج للبروتينين Nan وIav باستخدام برنامج AlphaFold264 لتحديد المناطق ذات الثقة المنخفضة. استند نمذجة الكالمودولين إلى مطابقة الأجسام الصلبة لنماذج ارتباط الكالسيوم ونماذج عدم ارتباطه، والموجودة في قاعدة بيانات البروتينات (PDB) برقمي الوصول 4JPZ56 و1CFD65 على التوالي. تم تحسين النماذج باستخدام التحسين الكروي لضمان صحة الكيمياء الفراغية وجودة الهندسة. بعد ذلك، تم نمذجة الفوسفاتيديل كولين والفوسفاتيديل إيثانولامين والفوسفاتيديل سيرين ككثافات دهنية محددة بدقة، ووُضعت روابط NAM وAP في الكثافات المقابلة لها في الوصلات المحكمة. تم إنشاء ملفات القيود من سلسلة SMILES للأشكال المتغايرة باستخدام برنامج eLBOW في PHENIX66. أخيرًا، جرى تحسين النماذج في الفضاء الحقيقي باستخدام برنامج PHENIX من خلال البحث الشبكي المحلي والتقليل العالمي مع مراعاة قيود البنية الثانوية. استُخدم خادم MolProbity لتحسين النموذج والتحليل البنيوي، ورُسمت الرسوم التوضيحية باستخدام PyMOL وUCSF Chimera X. 67،68،69 أُجري تحليل الفتحة باستخدام خادم HOLE،70 ورُسمت خرائط حفظ التسلسل باستخدام خادم Consurf.71
أُجري التحليل الإحصائي باستخدام برامج Igor Pro 6.2 وExcel Office 365 وGraphPad Prism 7.0. عُرضت جميع البيانات الكمية كمتوسط ± الخطأ المعياري (SEM). استُخدم اختبار t للطالب (ثنائي الطرف، غير مقترن) لمقارنة مجموعتين. استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Dunnett اللاحق لمقارنة عدة مجموعات. *P< 0.05، **P< 0.01، و ***Pتم اعتبار القيم الأقل من 0.001 ذات دلالة إحصائية بناءً على توزيع البيانات. تم حساب قيم Kd وKi وفترات الثقة غير المتماثلة بنسبة 95% باستخدام برنامج GraphPad Prism 10.
للحصول على مزيد من التفاصيل حول منهجية الدراسة، يرجى الاطلاع على ملخص تقرير Nature Portfolio المرفق في هذه المقالة.
تم بناء النموذج الأولي باستخدام نماذج الكالمودولين من قواعد بيانات PDB 4JPZ و 1CFD. وقد تم إيداع الإحداثيات في بنك بيانات البروتين (PDB) تحت أرقام الوصول التالية: 9NVN (Nan-Iav-CaM بدون ربيطة)، 9NVO (Nan-Iav-CaM مرتبط بالنيكوتيناميد)، 9NVP (Nan-Iav-CaM مرتبط بالنيكوتيناميد و EDTA)، 9NVQ (Nan-Iav-CaM مرتبط بالأفينيدولبيرولين والكالسيوم)، 9NVR (Nan-Iav-CaM مرتبط بالأفينيدولبيرولين و EDTA)، و 9NVS (خماسي نان مرتبط بالأفينيدولبيرولين). تم إيداع صور المجهر الإلكتروني فائق البرودة المقابلة في قاعدة بيانات المجهر الإلكتروني (EMDB) تحت أرقام الوصول التالية: EMD-49844 (مركب Nan-Iav-CaM بدون ربيطة)، EMD-49845 (مركب Nan-Iav-CaM مع نيكوتيناميد)، EMD-49846 (مركب Nan-Iav-CaM مع نيكوتيناميد وEDTA)، EMD-49847 (مركب Nan-Iav-CaM مع أفيدوبيرولين وكالسيوم)، EMD-49848 (مركب Nan-Iav-CaM مع أفيدوبيرولين وEDTA)، وEMD-49849 (مركب Nan خماسي الوحدات مع أفيدوبيرولين). وتُعرض البيانات الأولية للتحليل الوظيفي في هذه الورقة.
تاريخ النشر: 28 يناير 2026