دواء N,N-ثنائي إيثيل-م-تولواميد المضاد للديدان (ديتأُفيد أن مادة DEET تثبط إنزيم أستيل كولين إستراز (AChE) ولها خصائص مسرطنة محتملة نتيجة لتكوين الأوعية الدموية المفرط. في هذه الورقة البحثية، نُبين أن DEET يحفز على وجه التحديد الخلايا البطانية التي تعزز تكوين الأوعية الدموية، مما يزيد من نمو الورم. يُنشط DEET العمليات الخلوية المؤدية إلى تكوين الأوعية الدموية، بما في ذلك التكاثر والهجرة والالتصاق. ويرتبط ذلك بزيادة إنتاج أكسيد النيتريك (NO) وتعبير عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) في الخلايا البطانية. وقد أدى تثبيط مستقبل M3 أو استخدام مثبطات دوائية له إلى إلغاء جميع هذه التأثيرات، مما يشير إلى أن تكوين الأوعية الدموية الناتج عن DEET حساس لمستقبل M3. وتشير التجارب التي تتضمن إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية وخلايا HEK التي تُفرط في التعبير عن مستقبلات M3، بالإضافة إلى دراسات الارتباط والالتحام، إلى أن DEET يعمل كمعدل تفاعلي لمستقبلات M3. علاوة على ذلك، يثبط DEET إنزيم AChE، مما يزيد من التوافر البيولوجي للأستيل كولين وارتباطه بمستقبلات M3، ويعزز التأثيرات المحفزة لتكوين الأوعية الدموية من خلال التنظيم التآزري.
تم عزل الخلايا البطانية الأولية من الشريان الأورطي لفئران سويسرية. وقد تم تعديل طريقة الاستخلاص من بروتوكول كوباياشي 26. وتمت زراعة الخلايا البطانية الفأرية في وسط EBM-2 مدعم بنسبة 5% من مصل جنين البقر المعطل حرارياً حتى الجيل الرابع.
تم تحليل تأثير تركيزين من مادة DEET على تكاثر خلايا HUVEC وU87MG وBF16F10 باستخدام مجموعة CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). باختصار، زُرعت 5103 خلية في كل بئر من صفيحة ذات 96 بئرًا، وتُركت لتلتصق طوال الليل، ثم عُولجت بمادة DEET لمدة 24 ساعة. بعد إزالة وسط النمو، أُضيف محلول ربط الصبغة إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة، وحُضنت الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حُددت مستويات الفلورة باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع Mithras LB940 (Berthold Technologies، باد فيلدباد، ألمانيا) المزود بمرشحات إثارة عند 485 نانومتر ومرشحات انبعاث عند 530 نانومتر.
زُرعت خلايا HUVEC في صفائح ذات 96 بئراً بكثافة 104 خلايا لكل بئر. عُولجت الخلايا بمادة DEET لمدة 24 ساعة. قُيِّمَت حيوية الخلايا باستخدام اختبار MTT اللوني (Sigma-Aldrich، M5655). حُصِلَ على قيم الكثافة الضوئية باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع (Mithras LB940) عند طول موجي 570 نانومتر.
دُرست تأثيرات DEET باستخدام اختبارات تكوين الأوعية الدموية في المختبر. أدى العلاج بتركيز 10⁻⁸ مولار أو 10⁻⁵ مولار من DEET إلى زيادة طول الشعيرات الدموية في خلايا HUVECs (الشكل 1أ، ب، الأعمدة البيضاء). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، أظهر العلاج بتراكيز DEET التي تتراوح من 10⁻¹⁴ إلى 10⁻⁵ مولار أن طول الشعيرات الدموية وصل إلى حد أقصى عند تركيز 10⁻⁸ مولار من DEET (الشكل التكميلي S2). لم يُلاحظ فرقٌ ذو دلالة إحصائية في التأثير المحفز لتكوين الأوعية الدموية في المختبر لخلايا HUVECs المعالجة بـ DEET في نطاق التركيز 10⁻⁸ مولار و10⁻⁵ مولار.
لتحديد تأثير مادة DEET على تكوين الأوعية الدموية الجديدة، أجرينا دراسات على تكوين الأوعية الدموية الجديدة في الجسم الحي. بعد 14 يومًا، أظهرت الفئران المحقونة بخلايا بطانية تمت زراعتها مسبقًا مع 10-8 مولار أو 10-5 مولار من مادة DEET زيادة ملحوظة في محتوى الهيموجلوبين (الشكل 1ج، الأعمدة البيضاء).
علاوة على ذلك، دُرست عملية تكوين الأوعية الدموية الجديدة المُحفزة بواسطة DEET في فئران حاملة لزرع خلايا U87MG، حيث حُقنت يوميًا (داخل الصفاق) بـ DEET بجرعة معروفة بقدرتها على تحفيز تركيزات بلازما تبلغ 10-5 مولار، وهي تركيزات طبيعية لدى البشر المعرضين لها. في اليوم 23، لوحظت أورام قابلة للكشف (أي أورام يزيد حجمها عن 100 مم³) بعد 14 يومًا من حقن خلايا U87MG في الفئران. في اليوم 28، ازداد نمو الورم بشكل ملحوظ في الفئران المعالجة بـ DEET مقارنةً بفئران المجموعة الضابطة (الشكل 1د، المربعات). علاوة على ذلك، أظهر تلوين الأورام باستخدام CD31 أن DEET زاد بشكل ملحوظ من مساحة الشعيرات الدموية، ولكن ليس من كثافة الأوعية الدموية الدقيقة (الشكل 1هـ - ز).
لتحديد دور مستقبلات المسكارين في تكاثر الخلايا المحفز بواسطة DETA، استُخدم تركيز 10⁻⁸ مولار أو 10⁻⁵ مولار من DETA بوجود pFHHSiD (10⁻⁷ مولار، وهو مضاد انتقائي لمستقبلات M3). أدى علاج خلايا HUVEC بـ pFHHSiD إلى حجب خصائص التكاثر لـ DETA بشكل كامل عند جميع التركيزات (الجدول 1).
في ظل هذه الظروف، فحصنا أيضًا ما إذا كان DEET يزيد من طول الشعيرات الدموية في خلايا HUVEC. وبالمثل، منع pFHHSiD بشكل ملحوظ زيادة طول الشعيرات الدموية الناتجة عن DEET (الشكل 1أ، ب، الأعمدة الرمادية). علاوة على ذلك، أُجريت تجارب مماثلة باستخدام M3 siRNA. على الرغم من أن siRNA الضابط لم يكن فعالًا في تعزيز تكوين الشعيرات الدموية، إلا أن إسكات مستقبل M3 المسكاريني ألغى قدرة DEET على زيادة طول الشعيرات الدموية (الشكل 1أ، ب، الأعمدة السوداء).
علاوة على ذلك، تم تثبيط كل من تكوين الأوعية الدموية المُحفَّز بواسطة DEET بتركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار في المختبر وتكوين الأوعية الدموية الجديدة في الجسم الحي بشكل كامل بواسطة pFHHSiD (الشكل 1ج، د، الدوائر). تشير هذه النتائج إلى أن DEET يُعزز تكوين الأوعية الدموية عبر مسار حساس لمضادات مستقبلات M3 الانتقائية أو siRNA الخاص بمستقبلات M3.
يُعدّ إنزيم أستيل كولين إستراز (AChE) الهدف الجزيئي لـ DEET. تستطيع أدوية مثل دونيبيزيل، التي تعمل كمثبطات لإنزيم AChE، تحفيز تكوين الأوعية الدموية في الخلايا البطانية في المختبر وفي نماذج نقص التروية في الطرف الخلفي للفئران14. اختبرنا تأثير تركيزين من DEET على نشاط إنزيم AChE في خلايا HUVEC. أدى التركيز المنخفض (10-8 مولار) والتركيز العالي (10-5 مولار) من DEET إلى انخفاض نشاط إنزيم AChE في الخلايا البطانية مقارنةً بظروف التحكم (الشكل 2).
أدى كلا تركيزي DEET (10⁻⁸ مولار و10⁻⁵ مولار) إلى خفض نشاط أستيل كولين إستراز في خلايا HUVEC. استُخدمت خلايا BW284c51 (10⁻⁵ مولار) كعينة ضابطة لمثبطات أستيل كولين إستراز. عُبِّرت النتائج كنسبة مئوية لنشاط أستيل كولين إستراز في خلايا HUVEC المعالجة بتركيزي DEET مقارنةً بالخلايا المعالجة بالمذيب. عُبِّرت القيم كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط لست تجارب مستقلة. *قيمة p < 0.05 مقارنةً بالعينة الضابطة (اختبار كروسكال-واليس واختبار دن للمقارنات المتعددة).
يشارك أكسيد النيتريك (NO) في عملية تكوين الأوعية الدموية، ولذلك، دُرست عملية إنتاج أكسيد النيتريك في خلايا HUVECs المحفزة بواسطة DEET. ازداد إنتاج أكسيد النيتريك في الخلايا البطانية المعالجة بـ DEET مقارنةً بالخلايا الضابطة، لكن هذا الازدياد لم يصل إلى مستوى الدلالة الإحصائية إلا عند جرعة 10-8 مولار (الشكل 3ج). ولتحديد التغيرات الجزيئية التي تتحكم في إنتاج أكسيد النيتريك المحفز بواسطة DEET، تم تحليل تعبير وتفعيل إنزيم eNOS باستخدام تقنية Western blotting. على الرغم من أن المعالجة بـ DEET لم تُغير من تعبير eNOS، إلا أنها زادت بشكل ملحوظ من فسفرة eNOS في موقع التنشيط (Ser-1177) بينما قللت من فسفرة موقع التثبيط (Thr-495) مقارنةً بالخلايا غير المعالجة (الشكل 3د). علاوة على ذلك، حُسبت نسبة eNOS المفسفر في موقع التنشيط إلى موقع التثبيط بعد معايرة كمية eNOS المفسفر بالنسبة إلى الكمية الإجمالية للإنزيم. وقد زادت هذه النسبة بشكل ملحوظ في خلايا HUVECs المعالجة بكل تركيز من DEET مقارنة بالخلايا غير المعالجة (الشكل 3د).
وأخيرًا، تم تحليل التعبير عن عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، وهو أحد العوامل الرئيسية المحفزة لتكوين الأوعية الدموية، باستخدام تقنية التلطيخ الغربي. وقد أدى استخدام DEET إلى زيادة ملحوظة في التعبير عن VEGF، بينما أدى استخدام pFHHSiD إلى تثبيط هذا التعبير تمامًا.
بما أن تأثيرات DEET حساسة لكل من الحصار الدوائي وتثبيط مستقبلات M3، فقد اختبرنا فرضية أن DEET قد يعزز إشارات الكالسيوم. والمثير للدهشة أن DEET لم ينجح في زيادة الكالسيوم السيتوبلازمي في خلايا HUVEC (البيانات غير معروضة) وخلايا HEK/M3 (الشكل 4أ، ب) لكلا التركيزين المستخدمين.
تاريخ النشر: 30 ديسمبر 2024