الدواء المضاد للديدان N,N-diethyl-m-toluamide (مادة ديت) ثبت أنه يثبط إنزيم الأسيتيل كولينستراز (AChE)، وله خصائص مسرطنة محتملة بسبب فرط تكوين الأوعية الدموية. في هذه الورقة البحثية، نُظهر أن مادة DEET تُحفز الخلايا البطانية التي تُعزز تكوين الأوعية الدموية، مما يزيد من نمو الورم. تُنشط مادة DEET العمليات الخلوية المؤدية إلى تكوين الأوعية الدموية، بما في ذلك التكاثر والهجرة والالتصاق. يرتبط هذا بزيادة إنتاج أكسيد النيتريك (NO) وتعبير عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) في الخلايا البطانية. أدى إسكات M3 أو استخدام مثبطات M3 الدوائية إلى إلغاء جميع هذه التأثيرات، مما يُشير إلى أن تكوين الأوعية الدموية المُستحث بواسطة DEET حساس لمستقبلات M3. تُشير التجارب التي تتضمن إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية وخلايا HEK التي تُفرط في التعبير عن مستقبلات M3، بالإضافة إلى دراسات الارتباط والالتحام، إلى أن مادة DEET تعمل كمُعدِّل تآزري لمستقبلات M3. علاوة على ذلك، يعمل DEET على تثبيط AChE، وبالتالي زيادة التوافر البيولوجي للأستيل كولين وارتباطه بمستقبلات M3، وتعزيز التأثيرات المؤيدة لتكوين الأوعية الدموية من خلال التنظيم التآزري.
عُزلت الخلايا البطانية الأولية من الشريان الأورطي لفئران سويسرية. استُخدمت طريقة الاستخلاص المُقتبسة من بروتوكول كوباياشي 26 . زُرعت الخلايا البطانية الفأرية في وسط EBM-2 المُضاف إليه 5% من مصل الأبقار المُعطّل حرارياً حتى الدورة الرابعة.
تم تحليل تأثير تركيزين من مادة DEET على تكاثر خلايا HUVEC، أو U87MG، أو BF16F10 باستخدام مجموعة اختبار تكاثر الخلايا CyQUANT (المجسات الجزيئية، C7026). باختصار، تم زرع 5.103 خلية لكل بئر في صفيحة ذات 96 بئرًا، وتركها تلتصق طوال الليل، ثم عولجت بـ DEET لمدة 24 ساعة. بعد إزالة وسط النمو، أضف محلول ربط الصبغة إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة، واحتضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حُددت مستويات الفلورسنت باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة متعدد الأوضاع Mithras LB940 (تقنيات بيرتهولد، باد فيلدباد، ألمانيا) المزود بمرشحات إثارة بطول موجة 485 نانومتر ومرشحات انبعاث بطول موجة 530 نانومتر.
تم زرع خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC) في صفائح ذات 96 بئرًا بكثافة 104 خلايا لكل بئر. عولجت الخلايا بمادة DEET لمدة 24 ساعة. قُيِّمت حيوية الخلايا باستخدام اختبار MTT اللوني (Sigma-Aldrich, M5655). حُصل على قيم الكثافة الضوئية باستخدام قارئ صفائح دقيقة متعدد الأوضاع (Mithras LB940) بطول موجي 570 نانومتر.
دُرست تأثيرات مادة DEET باستخدام اختبارات تكوين الأوعية الدموية في المختبر. أدى العلاج بتركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار من مادة DEET إلى زيادة تكوين طول الشعيرات الدموية في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (الشكل 1أ، ب، الأشرطة البيضاء). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، أظهرت المعالجة بتركيزات DEET تتراوح بين 10-14 و10-5 مولار أن طول الشعيرات الدموية وصل إلى مستوى ثابت عند تركيز 10-8 مولار من مادة DEET (الشكل التكميلي S2). لم يُلاحظ أي فرق يُذكر في التأثير المحفز لتكوين الأوعية الدموية في المختبر لخلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية المعالجة بـ DEET في نطاق تركيز 10-8 مولار و10-5 مولار.
لتحديد تأثير مادة DEET على تكوين الأوعية الدموية الجديدة، أجرينا دراسات على الخلايا الحية. بعد 14 يومًا، أظهرت الفئران المحقونة بخلايا بطانية مزروعة مسبقًا بتركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار من مادة DEET زيادة ملحوظة في محتوى الهيموجلوبين (الشكل 1ج، الأشرطة البيضاء).
علاوةً على ذلك، دُرِسَ تكوين الأوعية الدموية الجديدة المُحفَّز بـ DEET لدى فئران U87MG الحاملة لزراعة أجنبية، والتي حُقِنَت يوميًا بـ DEET بجرعة معروفة بتحفيزها لتركيزات بلازما تبلغ 10-5 مولار، وهو معدل طبيعي لدى البشر المُعرَّضين. لُوحظت أورام قابلة للكشف (أي أورام >100 مم3) بعد 14 يومًا من حقن خلايا U87MG في الفئران. في اليوم الثامن والعشرين، تحسَّن نمو الورم بشكل ملحوظ لدى الفئران المُعالَجة بـ DEET مُقارنةً بفئران الضبط (الشكل 1د، المربعات). علاوةً على ذلك، أظهر تلطيخ الأورام بـ CD31 أن DEET زاد مساحة الشعيرات الدموية بشكل ملحوظ، ولكن ليس كثافة الأوعية الدقيقة. (الشكل 1هـ-ز).
لتحديد دور المستقبلات المسكارينية في تكاثر الخلايا المُحفَّز بـ DETA، استُخدم تركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار من DETA بوجود pFHHSiD (10-7 مولار، وهو مُضاد انتقائي لمستقبلات M3). في علاج خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC)، حجب pFHHSiD تمامًا الخصائص التكاثرية لـ DETA بجميع تركيزاتها (الجدول 1).
في ظل هذه الظروف، درسنا أيضًا ما إذا كان DEET يزيد من طول الشعيرات الدموية في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية البشرية. وبالمثل، منع pFHHSiD بشكل ملحوظ طول الشعيرات الدموية المُستحث بواسطة DEET (الشكل 1أ، ب، الأشرطة الرمادية). علاوة على ذلك، أُجريت تجارب مماثلة باستخدام M3 siRNA. على الرغم من أن siRNA الضابط لم يكن فعالًا في تعزيز تكوين الشعيرات الدموية، إلا أن إسكات مستقبلات M3 المسكارينية ألغى قدرة DEET على زيادة طول الشعيرات الدموية (الشكل 1أ، ب، الأشرطة السوداء).
علاوةً على ذلك، تم حجب كلٍّ من تكوين الأوعية الدموية المُستحثّ بواسطة مادة DEET بتركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار في المختبر وتكوين الأوعية الدموية الجديدة في الجسم الحيّ بالكامل بواسطة pFHHSiD (الشكل 1ج، د، الدوائر). تشير هذه النتائج إلى أن مادة DEET تُعزز تكوين الأوعية الدموية من خلال مسار حساس لمُضادات مستقبلات M3 الانتقائية أو M3 siRNA.
إنزيم الأسيتيل كولينستريز هو الهدف الجزيئي لمادة DEET. يمكن لأدوية مثل الدونيبيزيل، التي تعمل كمثبطات لمادة الأسيتيل كولينستريز، تحفيز تكوين الأوعية الدموية في الخلايا البطانية في المختبر وفي نماذج نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران14. اختبرنا تأثير تركيزين من مادة DEET على نشاط إنزيم الأسيتيل كولينستريز في الخلايا البطانية البشرية. أدت التركيزات المنخفضة (10-8 مولار) والعالية (10-5 مولار) من مادة DEET إلى انخفاض نشاط إنزيم الأسيتيل كولينستريز في الخلايا البطانية مقارنةً بظروف التحكم (الشكل 2).
أدى تركيزا DEET (١٠-٨ مولار و١٠-٥ مولار) إلى انخفاض نشاط الأسيتيل كولينستراز في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC). استُخدم BW284c51 (١٠-٥ مولار) كعينة ضابطة لمثبطات الأسيتيل كولينستراز. تُعبَّر النتائج كنسبة مئوية لنشاط الأسيتيل كولينستراز في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC) المعالجة بتركيزي DEET مقارنةً بالخلايا المعالجة بالناقل. تُعبَّر القيم كمتوسط ± خطأ معياري لست تجارب مستقلة. *p < 0.05 مقارنةً بالمجموعة الضابطة (اختبار كروسكال-واليس ودان للمقارنة المتعددة).
يشارك أكسيد النيتريك (NO) في عملية تكوين الأوعية الدموية 33، ولذلك، دُرِس إنتاج أكسيد النيتريك في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية المحفزة بـ DEET. ازداد إنتاج أكسيد النيتريك في الخلايا البطانية المعالجة بـ DEET مقارنةً بخلايا الضبط، ولكنه لم يصل إلى دلالة إحصائية إلا عند جرعة 10-8 مولار (الشكل 3ج). لتحديد التغيرات الجزيئية التي تتحكم في إنتاج أكسيد النيتريك المُحفز بـ DEET، تم تحليل تعبير وتنشيط eNOS باستخدام تقنية النقل الغربي. على الرغم من أن معالجة DEET لم تُغير تعبير eNOS، إلا أنها زادت بشكل ملحوظ من فسفرة eNOS في موقع التنشيط (Ser-1177) مع تقليل موقعه المثبط (Thr-495) مقارنةً بالخلايا غير المعالجة في فسفرة eNOS (الشكل 3د). علاوة على ذلك، تم حساب نسبة eNOS المُفسفرة في موقع التنشيط والموقع المثبط بعد تطبيع كمية eNOS المُفسفرة إلى الكمية الإجمالية للإنزيم. وقد زادت هذه النسبة بشكل ملحوظ في الخلايا البطانية البشرية المعالجة بكل تركيز من مادة DEET مقارنة بالخلايا غير المعالجة (الشكل 3د).
أخيرًا، تم تحليل التعبير عن VEGF، أحد أهم العوامل المحفزة لتكوين الأوعية الدموية، باستخدام تقنية النقل الغربي. زاد DEET بشكل ملحوظ من التعبير عن VEGF، بينما حجب pFHHSiD هذا التعبير تمامًا.
نظرًا لحساسية تأثيرات مادة DEET لكلٍّ من الحصار الدوائي وتثبيط مستقبلات M3، فقد اختبرنا فرضية أن مادة DEET قد تُعزز إشارات الكالسيوم. ومن المثير للدهشة أن مادة DEET لم تُعزز الكالسيوم السيتوبلازمي في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC) وخلايا HEK/M3 (الشكل 4أ، ب) لكلا التركيزين المُستخدمين.
وقت النشر: 30 ديسمبر 2024