الدواء المضاد للديدان N,N-diethyl-m-toluamide (مادة ديتأُفيد أن مادة DEET تُثبِّط إنزيم الأسيتيل كولينستراز (AChE)، ولها خصائص مُسرطنة محتملة بسبب فرط تكوين الأوعية الدموية. في هذه الدراسة، نُبيِّن أن مادة DEET تُحفِّز الخلايا البطانية تحديدًا، مما يُعزِّز نمو الورم. تُنشِّط مادة DEET العمليات الخلوية المؤدية إلى تكوين الأوعية الدموية، بما في ذلك التكاثر والهجرة والالتصاق. ويرتبط هذا بزيادة إنتاج أكسيد النيتريك (NO) وتعبير عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) في الخلايا البطانية. وقد ألغى إسكات M3 أو استخدام مثبطات M3 الدوائية جميع هذه التأثيرات، مما يُشير إلى أن تكوين الأوعية الدموية المُستحث بواسطة DEET حساس لمستقبلات M3. تُشير التجارب التي تتضمن إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية وخلايا HEK التي تُفرط في التعبير عن مستقبلات M3، بالإضافة إلى دراسات الارتباط والالتحام، إلى أن مادة DEET تعمل كمُعدِّل تآزري لمستقبلات M3. علاوة على ذلك، يعمل DEET على تثبيط AChE، وبالتالي زيادة التوافر البيولوجي للأستيل كولين وارتباطه بمستقبلات M3، وتعزيز التأثيرات المؤيدة لتكوين الأوعية الدموية من خلال التنظيم التآزري.
عُزلت الخلايا البطانية الأولية من الشريان الأورطي لفئران سويسرية. استُخدمت طريقة الاستخلاص المُقتبسة من بروتوكول كوباياشي 26 . زُرعت الخلايا البطانية الفأرية في وسط EBM-2 المُضاف إليه 5% من مصل الجنين البقري المُثبط حراريًا حتى الدورة الرابعة.
تم تحليل تأثير تركيزين من مادة DEET على تكاثر خلايا HUVEC، أو U87MG، أو BF16F10 باستخدام مجموعة اختبار تكاثر الخلايا CyQUANT (المجسات الجزيئية، C7026). باختصار، تم زرع 5.103 خلية لكل بئر في صفيحة ذات 96 بئرًا، وتركها تلتصق طوال الليل، ثم عولجت بـ DEET لمدة 24 ساعة. بعد إزالة وسط النمو، أضف محلول ربط الصبغة إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة، واحتضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حُددت مستويات الفلورسنت باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة متعدد الأوضاع Mithras LB940 (تقنيات بيرتهولد، باد فيلدباد، ألمانيا) المزود بمرشحات إثارة بطول 485 نانومتر ومرشحات انبعاث بطول 530 نانومتر.
تم زرع خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC) في صفائح ذات 96 بئرًا بكثافة 104 خلايا لكل بئر. عولجت الخلايا بمادة DEET لمدة 24 ساعة. قُيِّمت حيوية الخلايا باستخدام اختبار MTT اللوني (Sigma-Aldrich, M5655). تم الحصول على قيم الكثافة الضوئية باستخدام قارئ صفائح دقيقة متعدد الأوضاع (Mithras LB940) عند طول موجي 570 نانومتر.
دُرست تأثيرات مادة DEET باستخدام اختبارات تكوين الأوعية الدموية في المختبر. أدى العلاج بتركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار من مادة DEET إلى زيادة تكوين طول الشعيرات الدموية في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (الشكل 1أ، ب، الأشرطة البيضاء). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، أظهرت المعالجة بتركيزات DEET تتراوح بين 10-14 و10-5 مولار أن طول الشعيرات الدموية وصل إلى مستوى ثابت عند تركيز 10-8 مولار من مادة DEET (الشكل التكميلي S2). لم يُلاحظ أي فرق يُذكر في التأثير المحفز لتكوين الأوعية الدموية في المختبر لخلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية المعالجة بـ DEET في نطاق تركيز 10-8 مولار و10-5 مولار.
لتحديد تأثير مادة DEET على تكوين الأوعية الدموية الجديدة، أجرينا دراسات على الخلايا الوعائية الجديدة داخل الجسم الحي. بعد 14 يومًا، أظهرت الفئران المحقونة بخلايا بطانية مزروعة مسبقًا بتركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار من مادة DEET زيادة ملحوظة في محتوى الهيموجلوبين (الشكل 1ج، الأشرطة البيضاء).
علاوةً على ذلك، دُرست الأوعية الدموية الجديدة المُحفَّزة بمادة DEET لدى فئران U87MG الحاملة لزراعة غريبة، والتي حُقِنت يوميًا بمادة DEET بجرعة معروفة بتحفيزها لتركيزات بلازما تبلغ 10-5 مولار، وهو معدل طبيعي لدى البشر المُعرَّضين. لُوحظت أورام قابلة للكشف (أي أورام >100 مم3) بعد 14 يومًا من حقن خلايا U87MG في الفئران. في اليوم الثامن والعشرين، تحسَّن نمو الورم بشكل ملحوظ لدى الفئران المُعالَجة بمادة DEET مُقارنةً بفئران المجموعة الضابطة (الشكل 1د، المربعات). علاوةً على ذلك، أظهر تلطيخ الأورام بـ CD31 أن مادة DEET زادت مساحة الشعيرات الدموية بشكل ملحوظ، ولكن ليس كثافة الأوعية الدموية الدقيقة. (الشكل 1هـ-ز).
لتحديد دور المستقبلات المسكارينية في تكاثر الخلايا المُحفَّزة بـ DETA، استُخدم تركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار من DETA بوجود pFHHSiD (10-7 مولار، وهو مُضاد انتقائي لمستقبلات M3). في علاج خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC)، حجب تركيز pFHHSiD تمامًا الخصائص التكاثرية لـ DETA بجميع تركيزاتها (الجدول 1).
في ظل هذه الظروف، درسنا أيضًا ما إذا كان مركب DEET يزيد من طول الشعيرات الدموية في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC). وبالمثل، منع مركب pFHHSiD بشكل ملحوظ طول الشعيرات الدموية المُستحث بواسطة DEET (الشكل 1أ، ب، الأشرطة الرمادية). علاوة على ذلك، أُجريت تجارب مماثلة باستخدام siRNA M3. على الرغم من أن siRNA الضابط لم يكن فعالًا في تعزيز تكوين الشعيرات الدموية، إلا أن إسكات مستقبلات M3 المسكارينية ألغى قدرة DEET على زيادة طول الشعيرات الدموية (الشكل 1أ، ب، الأشرطة السوداء).
علاوةً على ذلك، تم حجب كلٍّ من تكوين الأوعية الدموية المُستحثّ بواسطة مادة DEET بتركيز 10-8 مولار أو 10-5 مولار في المختبر وتكوين الأوعية الدموية الجديدة في الجسم الحيّ بالكامل بواسطة pFHHSiD (الشكل 1ج، د، الدوائر). تشير هذه النتائج إلى أن مادة DEET تُعزّز تكوين الأوعية الدموية من خلال مسار حساس لمُضادات مستقبلات M3 الانتقائية أو M3 siRNA.
إنزيم الأسيتيل كولينستريز هو الهدف الجزيئي لمادة DEET. يمكن لأدوية مثل الدونيبيزيل، التي تعمل كمثبطات لمادة الأسيتيل كولينستريز، تحفيز تكوين الأوعية الدموية في الخلايا البطانية في المختبر وفي نماذج نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران14. اختبرنا تأثير تركيزين من مادة DEET على نشاط إنزيم الأسيتيل كولينستريز في الخلايا البطانية البشرية. أدت التركيزات المنخفضة (10-8 مولار) والعالية (10-5 مولار) من مادة DEET إلى انخفاض نشاط إنزيم الأسيتيل كولينستريز في الخلايا البطانية مقارنةً بظروف التحكم (الشكل 2).
أدى تركيزا DEET (١٠-٨ مولار و١٠-٥ مولار) إلى انخفاض نشاط الأستيل كولينستراز في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC). استُخدم BW284c51 (١٠-٥ مولار) كعينة ضابطة لمثبطات الأستيل كولينستراز. تُعبَّر النتائج كنسبة مئوية لنشاط الأستيل كولينستراز في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC) المعالجة بتركيزي DEET مقارنةً بالخلايا المعالجة بالناقل. تُعبَّر القيم كمتوسط ± خطأ معياري لست تجارب مستقلة. *p < 0.05 مقارنةً بالمجموعة الضابطة (اختبار كروسكال-واليس ودان للمقارنة المتعددة).
يشارك أكسيد النيتريك (NO) في عملية تكوين الأوعية الدموية 33، ولذلك، دُرِس إنتاج أكسيد النيتريك في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية المحفزة بـ DEET. ازداد إنتاج أكسيد النيتريك في الخلايا البطانية المعالجة بـ DEET مقارنةً بخلايا الضبط، ولكنه لم يصل إلى مستوى دلالة إحصائية إلا عند جرعة 10-8 مولار (الشكل 3ج). لتحديد التغيرات الجزيئية التي تتحكم في إنتاج أكسيد النيتريك المُحفز بـ DEET، تم تحليل تعبير وتنشيط eNOS باستخدام تقنية النقل الغربي. على الرغم من أن معالجة DEET لم تُغير تعبير eNOS، إلا أنها زادت بشكل ملحوظ من فسفرة eNOS في موقع التنشيط (Ser-1177) مع تقليل موقعه المثبط (Thr-495) مقارنةً بالخلايا غير المعالجة في فسفرة eNOS (الشكل 3د). علاوة على ذلك، حُسبت نسبة eNOS المُفسفرة في موقع التنشيط وموقع التثبيط بعد تطبيع كمية eNOS المُفسفرة إلى الكمية الإجمالية للإنزيم. تمت زيادة هذه النسبة بشكل ملحوظ في الخلايا البطانية البشرية المعالجة بكل تركيز من مادة DEET مقارنة بالخلايا غير المعالجة (الشكل 3د).
أخيرًا، تم تحليل التعبير عن عامل نمو الأوعية الدموية البطانية (VEGF)، أحد أهم العوامل المحفزة لتكوين الأوعية الدموية، باستخدام تقنية النقل الغربي. أدى استخدام مادة DEET إلى زيادة ملحوظة في التعبير عن عامل نمو الأوعية الدموية البطانية، في حين حجب مركب pFHHSiD هذا التعبير تمامًا.
نظرًا لحساسية تأثيرات مادة DEET لكلٍّ من الحصار الدوائي وتثبيط مستقبلات M3، فقد اختبرنا فرضية أن مادة DEET قد تُعزز إشارات الكالسيوم. ومن المثير للدهشة أن مادة DEET لم تُعزز الكالسيوم السيتوبلازمي في خلايا بطانة الأوعية الدموية البشرية (HUVEC) وخلايا HEK/M3 (الشكل 4أ، ب) لكلا التركيزين المُستخدمين.
وقت النشر: 30 ديسمبر 2024