التأثيرات التآزرية لمنظمات نمو النبات وجزيئات أكسيد الحديد النانوية على تكوين الأعضاء وإنتاج المركبات النشطة بيولوجيًا في نبتة سانت جون في المختبر

في هذه الدراسة، تم بحث التأثيرات التحفيزية للعلاج المركب لـمنظمات نمو النباتتمت دراسة تأثير كل من (2,4-D والكينيتين) وجزيئات أكسيد الحديد النانوية (Fe₃O₄-NPs) على التكوين المورفولوجي وإنتاج المستقلبات الثانوية في نبات *Hypericum perforatum* L. في المختبر. وقد أدى العلاج الأمثل [2,4-D (0.5 ملغم/لتر) + كينيتين (2 ملغم/لتر) + Fe₃O₄-NPs (4 ملغم/لتر)] إلى تحسين ملحوظ في مؤشرات نمو النبات: حيث زاد طول النبات بنسبة 59.6%، وطول الجذر بنسبة 114.0%، وعدد البراعم بنسبة 180.0%، والوزن الطازج للكالس بنسبة 198.3% مقارنةً بمجموعة التحكم. كما عزز هذا العلاج المركب كفاءة التجديد (50.85%) وزاد محتوى الهيبريسين بنسبة 66.6%. كشف تحليل GC-MS عن محتوى عالٍ من الهيبروسيد، وبيتا-باثولين، وكحول السيتيل، حيث شكلت هذه المركبات 93.36% من إجمالي مساحة الذروة، بينما زاد محتوى الفينولات والفلافونويدات الكلية بنسبة تصل إلى 80.1%. تشير هذه النتائج إلى أن منظمات نمو النبات (PGRs) وجزيئات أكسيد الحديد النانوية (Fe₃O₄-NPs) تُحدث تأثيرًا تآزريًا من خلال تحفيز تكوين الأعضاء وتراكم المركبات النشطة بيولوجيًا، مما يمثل استراتيجية واعدة للتحسين البيوتكنولوجي للنباتات الطبية.
نبتة سانت جون (Hypericum perforatum L.)، والمعروفة أيضًا باسم نبتة سانت جون، هي نبات عشبي معمر من الفصيلة الهايبريكاسيا، وله قيمة اقتصادية.[1] تشمل مكوناته النشطة بيولوجيًا المحتملة التانينات الطبيعية، والزانثونات، والفلوغلوسينول، والنفثالينديانثرون (الهيبرين والسودوهيبرين)، والفلافونويدات، والأحماض الفينولية، والزيوت العطرية.[2،3،4] يمكن إكثار نبتة سانت جون بالطرق التقليدية؛ ومع ذلك، فإن موسمية الطرق التقليدية، وانخفاض إنبات البذور، وقابليتها للإصابة بالأمراض تحد من إمكانية زراعتها على نطاق واسع وتكوين المستقلبات الثانوية بشكل مستمر.[1،5،6]
لذا، تُعتبر زراعة الأنسجة في المختبر طريقة فعّالة للإكثار السريع للنباتات، وحفظ الموارد الوراثية، وزيادة إنتاج المركبات الطبية [7، 8]. تلعب منظمات نمو النبات دورًا محوريًا في تنظيم التكوين الشكلي، وهي ضرورية لزراعة الكالس والكائنات الحية الكاملة في المختبر. يُعدّ تحسين تركيزاتها وتركيباتها أمرًا بالغ الأهمية لإتمام هذه العمليات التنموية بنجاح [9]. لذلك، يُعدّ فهم التركيب والتركيز المناسبين للمنظمات أمرًا مهمًا لتحسين نمو وقدرة نبات سانت جون (H. perforatum) على التجدد [10].
تُعدّ جسيمات أكسيد الحديد النانوية (Fe₃O₄) فئةً من الجسيمات النانوية التي طُوّرت أو يجري تطويرها لزراعة الأنسجة. يتميز Fe₃O₄ بخصائص مغناطيسية ملحوظة، وتوافق حيوي جيد، وقدرة على تعزيز نمو النبات وتقليل الإجهاد البيئي، مما جعله يحظى باهتمام كبير في تصميمات زراعة الأنسجة. تشمل التطبيقات المحتملة لهذه الجسيمات النانوية تحسين الزراعة المختبرية لتعزيز انقسام الخلايا، وتحسين امتصاص العناصر الغذائية، وتنشيط الإنزيمات المضادة للأكسدة [11].
على الرغم من أن الجسيمات النانوية أظهرت تأثيرات محفزة جيدة لنمو النبات، إلا أن الدراسات التي تتناول التطبيق المشترك لجسيمات أكسيد الحديد الثلاثي النانوية ومنظمات النمو النباتية المُحسَّنة في نبات *H. perforatum* لا تزال قليلة. لسد هذه الفجوة المعرفية، قيّمت هذه الدراسة تأثيراتهما المشتركة على التكوين المورفولوجي وإنتاج المستقلبات الثانوية في المختبر، بهدف تقديم رؤى جديدة لتحسين خصائص النباتات الطبية. ولذلك، تهدف هذه الدراسة إلى تحقيق هدفين رئيسيين: (1) تحسين تركيز منظمات النمو النباتية لتعزيز تكوين الكالس، وتجديد البراعم، وتكوين الجذور في المختبر بشكل فعال؛ و(2) تقييم تأثيرات جسيمات أكسيد الحديد الثلاثي النانوية على معايير النمو في المختبر. تشمل الخطط المستقبلية تقييم معدل بقاء النباتات المُجددة خلال فترة التأقلم (في المختبر). من المتوقع أن تُسهم نتائج هذه الدراسة بشكل كبير في تحسين كفاءة الإكثار الدقيق لنبات *H. perforatum*، مما يُعزز الاستخدام المستدام والتطبيقات التقنية الحيوية لهذا النبات الطبي الهام.
في هذه الدراسة، استخلصنا أجزاءً ورقية من نباتات نبتة سانت جون الحولية المزروعة في الحقل (النباتات الأم). استُخدمت هذه الأجزاء لتحسين ظروف الزراعة النسيجية. قبل الزراعة، غُسلت الأوراق جيدًا تحت الماء المقطر الجاري لعدة دقائق. ثم عُقّمت أسطح الأجزاء بغمرها في محلول إيثانول بتركيز 70% لمدة 30 ثانية، ثم في محلول هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl) بتركيز 1.5% يحتوي على بضع قطرات من توين 20 لمدة 10 دقائق. أخيرًا، غُسلت الأجزاء ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم قبل نقلها إلى وسط الزراعة التالي.
على مدار الأسابيع الأربعة التالية، تم قياس معايير تجديد النموات، بما في ذلك معدل التجديد، وعدد النموات لكل جزء نباتي، وطول النموات. عندما بلغ طول النموات المتجددة 2 سم على الأقل، نُقلت إلى وسط تجذير مكون من وسط MS بنصف تركيزه، و0.5 ملغم/لتر من حمض الإندول بيوتيريك (IBA)، و0.3% من صمغ الغوار. استمرت عملية التجذير لمدة ثلاثة أسابيع، تم خلالها قياس معدل التجذير، وعدد الجذور، وطولها. كُررت كل معاملة ثلاث مرات، مع زراعة 10 أجزاء نباتية لكل تكرار، مما أسفر عن حوالي 30 جزءًا نباتيًا لكل معاملة.
قُيس طول النبات بالسنتيمتر (سم) باستخدام مسطرة، من قاعدة النبات إلى طرف أطول ورقة. وقُيس طول الجذر بالملليمتر (مم) مباشرةً بعد إزالة الشتلات بعناية وإزالة وسط النمو. وتمّ عدّ عدد البراعم في كل جزء نباتي مباشرةً على كل نبات. كما تمّ قياس عدد البقع السوداء على الأوراق، والمعروفة بالعُقيدات، بصريًا. ويُعتقد أن هذه العُقيدات السوداء غدد تحتوي على الهيبريسين، أو بقع مؤكسدة، وتُستخدم كمؤشر فسيولوجي لاستجابة النبات للمعالجة. بعد إزالة وسط النمو بالكامل، قُيس الوزن الطازج للشتلات باستخدام ميزان إلكتروني بدقة ملليغرام (ملغ).
تُحسب نسبة تكوّن الكالس كما يلي: بعد زراعة الأجزاء النباتية في وسط يحتوي على منظمات نمو مختلفة (كينازات، 2,4-D، وFe3O4) لمدة أربعة أسابيع، يُحصى عدد الأجزاء النباتية القادرة على تكوين الكالس. وتُستخدم الصيغة التالية لحساب نسبة تكوّن الكالس:
تم تكرار كل علاج ثلاث مرات، مع فحص ما لا يقل عن 10 عينات في كل تكرار.
يعكس معدل التجدد نسبة نسيج الكالس الذي يُكمل بنجاح عملية تمايز البراعم بعد مرحلة تكوين الكالس. ويُظهر هذا المؤشر قدرة نسيج الكالس على التحول إلى نسيج متمايز والنمو إلى أعضاء نباتية جديدة.
معامل التجذير هو نسبة عدد الفروع القادرة على التجذير إلى إجمالي عدد الفروع. ويعكس هذا المؤشر نجاح مرحلة التجذير، وهي مرحلة حاسمة في الإكثار الدقيق وإكثار النباتات، إذ يساعد التجذير الجيد الشتلات على البقاء بشكل أفضل في ظروف النمو.
استُخلصت مركبات الهيبريسين باستخدام الميثانول بنسبة 90%. أُضيف 50 ملغ من المادة النباتية المجففة إلى 1 مل من الميثانول، وخُضعت للمعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة بتردد 30 كيلوهرتز في جهاز تنظيف بالموجات فوق الصوتية (طراز A5120-3YJ) في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، خُضعت العينة للطرد المركزي بسرعة 6000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. جُمع السائل الطافي، وقُيس امتصاص الهيبريسين عند 592 نانومتر باستخدام مطياف Plus-3000 S وفقًا للطريقة الموصوفة من قِبل كونسيساو وآخرون [14].
لم تُحفّز معظم المعالجات باستخدام منظمات نمو النبات (PGRs) وجزيئات أكسيد الحديد النانوية (Fe₃O₄-NPs) تكوين عُقيدات سوداء على أوراق البراعم المُتجددة. لم تُلاحظ أي عُقيدات في أي من المعالجات التي استخدمت 0.5 أو 1 ملغم/لتر من 2,4-D، أو 0.5 أو 1 ملغم/لتر من الكينيتين، أو 1 أو 2 أو 4 ملغم/لتر من جزيئات أكسيد الحديد النانوية. أظهرت بعض التركيبات زيادة طفيفة في نمو العُقيدات (لكنها غير ذات دلالة إحصائية) عند التركيزات العالية من الكينيتين و/أو جزيئات أكسيد الحديد النانوية، مثل تركيبة 2,4-D (0.5-2 ملغم/لتر) مع الكينيتين (1-1.5 ملغم/لتر) وجزيئات أكسيد الحديد النانوية (2-4 ملغم/لتر). تُوضح هذه النتائج في الشكل 2. تُمثل العُقيدات السوداء غددًا غنية بالهايبريسين، وهي غدد طبيعية ومفيدة. في هذه الدراسة، ارتبطت العُقيدات السوداء بشكل رئيسي بتحول الأنسجة إلى اللون البني، مما يشير إلى بيئة مواتية لتراكم الهيبريسين. وقد عزز العلاج بـ 2,4-D والكينيتين وجزيئات أكسيد الحديد النانوية نمو الكالس، وقلل من تحول الأنسجة إلى اللون البني، وزاد من محتوى الكلوروفيل، مما يوحي بتحسن الوظائف الأيضية وإمكانية الحد من الأضرار التأكسدية [37]. قيّمت هذه الدراسة تأثيرات الكينيتين مع 2,4-D وجزيئات أكسيد الحديد النانوية على نمو وتطور كالس نبتة سانت جون (الشكل 3أ-ز). أظهرت دراسات سابقة أن جزيئات أكسيد الحديد النانوية لها خصائص مضادة للفطريات والميكروبات [38، 39]، وعند استخدامها مع منظمات نمو النبات، يمكنها تحفيز آليات الدفاع النباتية وتقليل مؤشرات الإجهاد الخلوي [18]. على الرغم من أن التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية مُنظم وراثيًا، إلا أن إنتاجها الفعلي يعتمد بشكل كبير على الظروف البيئية. يمكن للتغيرات الأيضية والمورفولوجية أن تؤثر على مستويات المستقلبات الثانوية من خلال تنظيم التعبير عن جينات نباتية محددة والاستجابة للعوامل البيئية. علاوة على ذلك، يمكن للمحفزات أن تحفز تنشيط جينات جديدة، والتي بدورها تحفز النشاط الإنزيمي، مما يؤدي في النهاية إلى تنشيط مسارات التخليق الحيوي المتعددة وتكوين المستقلبات الثانوية. كما أظهرت دراسة أخرى أن تقليل التظليل يزيد من التعرض لأشعة الشمس، وبالتالي يرفع درجات حرارة النهار في الموطن الطبيعي لنبات *Hypericum perforatum*، مما يساهم أيضًا في زيادة إنتاج الهيبريسين. بناءً على هذه البيانات، بحثت هذه الدراسة دور جزيئات الحديد النانوية كمحفزات محتملة في زراعة الأنسجة. أظهرت النتائج أن هذه الجزيئات النانوية يمكنها تنشيط الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للهيسبيريدين من خلال التحفيز الإنزيمي، مما يؤدي إلى زيادة تراكم هذا المركب (الشكل 2). لذلك، بالمقارنة مع النباتات التي تنمو في الظروف الطبيعية، يمكن القول إن إنتاج هذه المركبات في الجسم الحي يمكن تعزيزه أيضًا عند دمج الإجهاد المعتدل مع تنشيط الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية. تُؤثر المعالجات المُركبة عمومًا بشكل إيجابي على معدل التجدد، ولكن في بعض الحالات، يضعف هذا التأثير. والجدير بالذكر أن المعالجة بـ 1 ملغم/لتر من 2,4-D، و1.5 ملغم/لتر من الكيناز، وتراكيز مختلفة، استطاعت بشكل مستقل وملحوظ زيادة معدل التجدد بنسبة 50.85% مقارنةً بمجموعة التحكم (الشكل 4ج). تُشير هذه النتائج إلى أن تركيبات مُحددة من الهرمونات النانوية يُمكن أن تعمل بتآزر لتعزيز نمو النبات وإنتاج المُستقلبات، وهو أمر ذو أهمية بالغة لزراعة أنسجة النباتات الطبية. وقد أظهر بالمر وكيلر [50] أن المعالجة بـ 2,4-D يُمكن أن تُحفز بشكل مستقل تكوين الكالس في نبات سانت بيرفوراتوم، بينما أدت إضافة الكيناز إلى تعزيز تكوين الكالس والتجدد بشكل ملحوظ. ويعود هذا التأثير إلى تحسين التوازن الهرموني وتحفيز انقسام الخلايا. كما وجد بال وآخرون [51] أن المعالجة بجزيئات أكسيد الحديد النانوية (Fe₃O₄-NP) يُمكن أن تُعزز بشكل مستقل وظيفة إنزيمات مضادات الأكسدة، وبالتالي تُعزز نمو الجذور في نبات سانت بيرفوراتوم. أدى استخدام أوساط زراعية تحتوي على جسيمات نانوية من أكسيد الحديد الثلاثي (Fe₃O₄) بتراكيز 0.5 ملغم/لتر، و1 ملغم/لتر، و1.5 ملغم/لتر إلى تحسين معدل تجدد نباتات الكتان [52]. كما أدى استخدام الكينيتين، و2،4-ثنائي كلورو بنزوثيازولينون، وجسيمات أكسيد الحديد الثلاثي النانوية إلى تحسين ملحوظ في معدلات تكوين الكالس والجذور، إلا أنه ينبغي مراعاة الآثار الجانبية المحتملة لاستخدام هذه الهرمونات في التجديد المختبري. فعلى سبيل المثال، قد يؤدي الاستخدام طويل الأمد أو بتراكيز عالية من 2،4-ثنائي كلورو بنزوثيازولينون أو الكينيتين إلى تباين استنساخي جسدي، أو إجهاد تأكسدي، أو تشوهات في شكل الكالس، أو تزجج. لذا، فإن ارتفاع معدل التجدد لا يضمن بالضرورة الاستقرار الوراثي. ينبغي تقييم جميع النباتات المتجددة باستخدام المؤشرات الجزيئية (مثل RAPD و ISSR و AFLP) أو التحليل الخلوي الوراثي لتحديد تجانسها وتشابهها مع النباتات الموجودة في الجسم الحي [53،54،55].
أظهرت هذه الدراسة لأول مرة أن الاستخدام المشترك لمنظمات نمو النبات (2,4-D والكينيتين) مع جسيمات أكسيد الحديد النانوية (Fe₃O₄) يُحسّن من تكوين الأنسجة وتراكم المستقلبات النشطة بيولوجيًا الرئيسية (بما في ذلك الهيبريسين والهايبروسيد) في نبات *Hypericum perforatum*. لم يُحسّن نظام المعالجة الأمثل (1 ملغم/لتر من 2,4-D + 1 ملغم/لتر من الكينيتين + 4 ملغم/لتر من جسيمات أكسيد الحديد النانوية) من تكوين الكالس وتكوين الأعضاء وإنتاج المستقلبات الثانوية فحسب، بل أظهر أيضًا تأثيرًا تحفيزيًا طفيفًا، مما يُحتمل أن يُحسّن من قدرة النبات على تحمل الإجهاد وقيمته الطبية. يوفر الجمع بين تقنية النانو وزراعة الأنسجة النباتية منصة مستدامة وفعالة لإنتاج المركبات الطبية على نطاق واسع في المختبر. تمهد هذه النتائج الطريق للتطبيقات الصناعية والبحوث المستقبلية في الآليات الجزيئية وتحسين الجرعات والدقة الجينية، وبالتالي تربط البحوث الأساسية على النباتات الطبية بالتكنولوجيا الحيوية التطبيقية.