يكشف المستشعر الحيوي الكمي للجبريلين عن دور الجبريلين في مواصفات العقد الداخلية في النسيج البنائي القمي للبراعم

نموّ قمة البراعم (SAM) أمرٌ بالغ الأهمية لبنية الساق. هرمونات النباتالجبرليناتتلعب (GAs) أدوارًا رئيسية في تنسيق نمو النبات، إلا أن دورها في SAM لا يزال غير مفهوم جيدًا. هنا، قمنا بتطوير مستشعر بيولوجي نسبي لإشارات GA من خلال هندسة بروتين DELLA لقمع وظيفته التنظيمية الأساسية في الاستجابة النسخية لـ GA مع الحفاظ على تحلله عند التعرف على GA. نوضح أن هذا المستشعر البيولوجي القائم على التحلل يسجل بدقة التغيرات في مستويات GA والاستشعار الخلوي أثناء النمو. استخدمنا هذا المستشعر البيولوجي لرسم خريطة لنشاط إشارات GA في SAM. نوضح أن إشارات GA العالية موجودة بشكل رئيسي في الخلايا الواقعة بين بدائيات الأعضاء، وهي أسلاف الخلايا بين العقد. باستخدام مناهج اكتساب الوظيفة وفقدانها، نوضح أيضًا أن GA ينظم اتجاه مستوى انقسام الخلية، مما يؤسس للتنظيم الخلوي القياسي للعقد، وبالتالي يعزز مواصفات العقد في SAM.
يحتوي النسيج الإنشائي القمي للبراعم (SAM)، الواقع عند قمة البرعم، على كوة من الخلايا الجذعية التي يُولّد نشاطها أعضاءً جانبية وعقدًا جذعية بطريقة نمطية وتكرارية طوال عمر النبات. تتضمن كل وحدة من هذه الوحدات المتكررة، أو العقد النباتية، عقدًا داخلية وأعضاءً جانبية عند العقد، وخلايا إبطية في آباط الأوراق1. يتغير نمو وتنظيم العقد النباتية أثناء النمو. في نبات الأرابيدوبسيس، يُكبت النمو الداخلي خلال المرحلة الخضرية، وتبقى الخلايا الإبطية الإبطية خاملة في آباط أوراق الوردة. خلال الانتقال إلى المرحلة الزهرية، يصبح SAM النسيج الإنشائي للإزهار، مُولّدًا عقدًا داخلية وبراعمًا إبطية طويلة، وأغصانًا صغيرة في آباط أوراق الجذع، وأزهارًا لاحقًا عديمة الأوراق2. على الرغم من أننا أحرزنا تقدمًا كبيرًا في فهم الآليات التي تتحكم في بداية نمو الأوراق والزهور والفروع، إلا أننا لا نعرف إلا القليل نسبيًا عن كيفية نشوء العقد.
سيساعد فهم التوزيع المكاني الزمني للأحماض الأمينية الغينية (GAs) على فهم وظائف هذه الهرمونات بشكل أفضل في الأنسجة المختلفة وفي مراحل النمو المختلفة. يوفر تصوير تحلل اندماج RGA-GFP المعبر عنه بفعل مُحفِّزه الخاص معلومات مهمة حول تنظيم مستويات GA الكلية في الجذور15،16. ومع ذلك، يختلف التعبير عن RGA باختلاف الأنسجة17، وينظمه GA18. وبالتالي، قد يؤدي التعبير التفاضلي لمُحفِّز RGA إلى نمط الفلورة الملحوظ مع RGA-GFP، وبالتالي فإن هذه الطريقة ليست كمية. في الآونة الأخيرة، كشف GA19،20 الموسوم بالفلوريسين النشط بيولوجيًا (Fl) عن تراكم GA في القشرة الداخلية للجذر وتنظيم مستوياته الخلوية عن طريق نقل GA. مؤخرًا، أظهر مستشعر GA FRET nlsGPS1 أن مستويات GA ترتبط باستطالة الخلايا في الجذور والخيوط والبراعم السفلية داكنة النمو21. ومع ذلك، وكما رأينا، فإن تركيز حمض الغلوتاميك ليس العامل الوحيد المتحكم في نشاط إشارات حمض الغلوتاميك، إذ يعتمد على عمليات استشعار معقدة. هنا، وبناءً على فهمنا لمسارات إشارات DELLA وحمض الغلوتاميك، نُبلغ عن تطوير وتوصيف مستشعر بيولوجي نسبي قائم على التحلل لإشارات حمض الغلوتاميك. لتطوير هذا المستشعر البيولوجي الكمي، استخدمنا بروتين RGA متحورًا حساسًا لحمض الغلوتاميك، مُدمجًا مع بروتين فلوري، ومُعبَّر عنه في كل مكان في الأنسجة، بالإضافة إلى بروتين فلوري غير حساس لحمض الغلوتاميك. نُظهر أن اندماج بروتين RGA المتحور لا يتداخل مع إشارات حمض الغلوتاميك الذاتية عند التعبير عنه في كل مكان، وأن هذا المستشعر البيولوجي قادر على تحديد نشاط الإشارات الناتج عن كل من مدخلات حمض الغلوتاميك ومعالجتها بواسطة جهاز الاستشعار بدقة مكانية زمانية عالية. استخدمنا هذا المستشعر الحيوي لرسم خريطة التوزيع المكاني الزمني لنشاط إشارات حمض الغلوتاميك، ولتحديد كيفية تنظيمه للسلوك الخلوي في بشرة العقدة اللمفاوية الشحمية (SAM). ونوضح أن حمض الغلوتاميك ينظم اتجاه مستوى انقسام خلايا العقدة اللمفاوية الشحمية (SAM) الواقعة بين البدائيات العضوية، مما يُحدد التنظيم الخلوي التقليدي للعقدة اللمفاوية.
أخيرًا، تساءلنا عمّا إذا كان بإمكان qmRGA الإبلاغ عن تغيرات في مستويات حمض الغليكوليك الداخلي باستخدام نموّ البراعم الهابوكوتيلية. سبق أن أوضحنا أن النترات تحفز النمو عن طريق زيادة تخليق حمض الغليكوليك، وبالتالي تحلل DELLA34. بناءً على ذلك، لاحظنا أن طول البراعم الهابوكوتيلية في شتلات pUBQ10::qmRGA المزروعة في ظلّ وفرة من النترات (10 ملي مولار NO3−) كان أطول بكثير منه في الشتلات المزروعة في ظلّ نقص النترات (الشكل التكميلي 6أ). وتماشيًا مع استجابة النمو، كانت إشارات حمض الغليكوليك أعلى في البراعم الهابوكوتيلية للشتلات المزروعة في ظلّ 10 ملي مولار NO3− مقارنةً بالشتلات المزروعة في ظلّ غياب النترات (الشكل التكميلي 6ب، ج). وبالتالي، يُمكّن qmRGA أيضًا من رصد التغيرات في إشارات حمض الغليكوليك الناتجة عن التغيرات الداخلية في تركيز حمض الغليكوليك.
لفهم ما إذا كان نشاط إشارات GA المكتشف بواسطة qmRGA يعتمد على تركيز GA وإدراك GA، كما هو متوقع بناءً على تصميم المستشعر، قمنا بتحليل التعبير عن مستقبلات GID1 الثلاثة في الأنسجة الخضرية والتكاثرية. في الشتلات، أظهر خط المراسل GID1-GUS أن التعبير عن GID1a وc كان مرتفعًا في الفلقات (الشكل 3أ-ج). بالإضافة إلى ذلك، تم التعبير عن جميع المستقبلات الثلاثة في الأوراق، وبراعم الجذور الجانبية، وأطراف الجذور (باستثناء غطاء جذر GID1b)، والجهاز الوعائي (الشكل 3أ-ج). في SAM الإزهاري، اكتشفنا إشارات GUS فقط لـ GID1b و1c (الشكل التكميلي 7أ-ج). أكد التهجين الموضعي أنماط التعبير هذه، وأظهر أيضًا أن التعبير عن GID1c كان موحدًا بمستويات منخفضة في SAM، بينما أظهر GID1b تعبيرًا أعلى على محيط SAM (الشكل التكميلي 7د-ل). كشف الاندماج الانتقالي pGID1b::2xmTQ2-GID1b أيضًا عن نطاق متدرج لتعبير GID1b، يتراوح من انخفاض أو انعدام التعبير في مركز SAM إلى تعبير مرتفع عند حدود الأعضاء (الشكل التكميلي 7م). وبالتالي، لا تتوزع مستقبلات GID1 بشكل متساوٍ عبر الأنسجة وداخلها. في تجارب لاحقة، لاحظنا أيضًا أن الإفراط في التعبير عن GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) زاد من حساسية qmRGA في الخلايا تحت الوريقات لتطبيق GA الخارجي (الشكل 3د، هـ). في المقابل، كان الفلورسنت المقاس بواسطة qd17mRGA في الخلايا تحت الوريقات غير حساس لعلاج GA3 (الشكل 3و، ز). في كلا الاختبارين، عولجت الشتلات بتركيزات عالية من GA (100 ميكرومولار GA3) لتقييم السلوك السريع للمستشعر، حيث تعززت أو فقدت قدرته على الارتباط بمستقبل GID1. تؤكد هذه النتائج مجتمعة أن المستشعر الحيوي qmRGA يؤدي وظيفة مشتركة كمستشعر GA وGA، وتشير إلى أن التعبير التفاضلي لمستقبل GID1 يمكن أن يعمل على تعديل انبعاثية المستشعر بشكل كبير.
حتى الآن، لا يزال توزيع إشارات GA في SAM غير واضح. لذلك، استخدمنا نباتات معبرة عن qmRGA وجهاز مراسل الخلايا الجذعية pCLV3::mCherry-NLS35 لحساب خرائط كمية عالية الدقة لنشاط إشارات GA، مع التركيز على الطبقة L1 (البشرة؛ الشكل 4أ، ب، انظر الطرق والطرق التكميلية)، نظرًا لدور L1 المحوري في التحكم في نمو SAM36. هنا، وفّر تعبير pCLV3::mCherry-NLS نقطة مرجعية هندسية ثابتة لتحليل التوزيع المكاني الزمني لنشاط إشارات GA37. على الرغم من أن GA يُعتبر ضروريًا لنمو الأعضاء الجانبية4، فقد لاحظنا أن إشارات GA كانت منخفضة في البادئة الزهرية (P) بدءًا من مرحلة P3 (الشكل 4أ، ب)، بينما أظهرت البادئات الصغيرة P1 وP2 نشاطًا معتدلًا مشابهًا للنشاط في المنطقة الوسطى (الشكل 4أ، ب). تم الكشف عن نشاط إشارات GA العالي عند حدود البدائيات العضوية، بدءًا من P1/P2 (على جانبي الحد) وبلوغ ذروته عند P4، وكذلك في جميع خلايا المنطقة الطرفية الواقعة بين البدائيات (الشكل 4أ، ب والشكل التكميلي 8أ، ب). لم يُلاحظ هذا النشاط العالي لإشارات GA في البشرة فحسب، بل أيضًا في الطبقات L2 وL3 العليا (الشكل التكميلي 8ب). كما ظل نمط إشارات GA المكتشفة في SAM باستخدام qmRGA دون تغيير بمرور الوقت (الشكل التكميلي 8ج-و، ك). على الرغم من أن بنية qd17mRGA قد تم تخفيض تنظيمها بشكل منهجي في SAM لنباتات T3 من خمسة سلالات مستقلة وصفناها بالتفصيل، فقد تمكنا من تحليل أنماط الفلورسنت التي تم الحصول عليها باستخدام بنية pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (الشكل التكميلي 8ز-ي، ل). في خط التحكم هذا، لم تُكتشف سوى تغيرات طفيفة في نسبة الفلورسنت في SAM، ولكن في مركز SAM، لاحظنا انخفاضًا واضحًا وغير متوقع في VENUS مرتبطًا بـ TagBFP. يؤكد هذا أن نمط الإشارة الذي رصده qmRGA يعكس تدهور mRGA-VENUS المعتمد على GA، ولكنه يُظهر أيضًا أن qmRGA قد يُبالغ في تقدير نشاط إشارات GA في مركز النسيج الإنشائي. باختصار، تكشف نتائجنا عن نمط إشارة GA يعكس بشكل أساسي توزيع الخلايا البدائية. يُعزى هذا التوزيع للمنطقة بين الخلايا البدائية (IPR) إلى التأسيس التدريجي لنشاط إشارات GA المرتفع بين الخلايا البدائية النامية والمنطقة المركزية، بينما ينخفض ​​في الوقت نفسه نشاط إشارات GA في الخلايا البدائية (الشكل 4ج، د).
يشير توزيع مستقبلات GID1b وGID1c (انظر أعلاه) إلى أن التعبير التفاضلي لمستقبلات GA يُسهم في تشكيل نمط نشاط إشارات GA في SAM. تساءلنا عمّا إذا كان التراكم التفاضلي لـ GA مُرتبطًا. وللتحقق من هذا الاحتمال، استخدمنا مستشعر انتقال الرنين المغناطيسي النووي nlsGPS1 GA FRET21. رُصدت زيادة في وتيرة التنشيط في SAM لـ nlsGPS1 المُعالج بـ 10 ميكرومولار من GA4+7 لمدة 100 دقيقة (الشكل التكميلي 9أ-هـ)، مما يُشير إلى أن nlsGPS1 يستجيب للتغيرات في تركيز GA في SAM، كما هو الحال في الجذور21. كشف التوزيع المكاني لتردد تنشيط nlsGPS1 عن مستويات منخفضة نسبيًا من GA في الطبقات الخارجية من SAM، ولكنه أظهر ارتفاعًا في مركز SAM وعلى حدوده (الشكل 4هـ والشكل التكميلي 9أ، ج). يشير هذا إلى أن GA موزع أيضًا في SAM بنمط مكاني مماثل لما كشفت عنه qmRGA. وكنهج تكميلي، عالجنا أيضًا SAM باستخدام GA الفلوري (GA3-، GA4-، GA7-Fl) أو Fl وحده كعنصر تحكم سلبي. تم توزيع إشارة Fl في جميع أنحاء SAM، بما في ذلك المنطقة المركزية والبدائية، وإن كان ذلك بكثافة أقل (الشكل 4j والشكل التكميلي 10d). في المقابل، تراكمت جميع GA-Fl الثلاثة بشكل خاص داخل حدود البدائية وبدرجات متفاوتة في بقية IPR، مع تراكم GA7-Fl في أكبر نطاق في IPR (الشكل 4k والشكل التكميلي 10a،b). كشف تحديد كمية شدة الفلورسنت أن نسبة شدة IPR إلى شدة غير IPR كانت أعلى في SAM المعالجة بـ GA-Fl مقارنة بـ SAM المعالجة بـ Fl (الشكل 4l والشكل التكميلي 10c). تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى وجود حمض الجبريليك بتركيزات أعلى في خلايا IPR الأقرب إلى حدود العضو. ويشير هذا إلى أن نمط نشاط إشارات حمض الجبريليك في SAM ينتج عن التعبير التفاضلي لمستقبلات حمض الجبريليك والتراكم التفاضلي لحمض الجبريليك في خلايا IPR القريبة من حدود العضو. وبالتالي، كشف تحليلنا عن نمط مكاني زماني غير متوقع لإشارات حمض الجبريليك، مع انخفاض النشاط في مركز وبداية الخلية SAM، وارتفاع النشاط في IPR في المنطقة الطرفية.
لفهم دور نشاط إشارات GA التفاضلي في SAM، قمنا بتحليل العلاقة بين نشاط إشارات GA وتمدد الخلايا وانقسامها باستخدام التصوير الفاصل الزمني الفوري لـ qmRGA pCLV3::mCherry-NLS في SAM. ونظرًا لدور GA في تنظيم النمو، كان من المتوقع وجود ارتباط إيجابي مع معايير تمدد الخلايا. لذلك، قارنا أولًا خرائط نشاط إشارات GA بخرائط معدل نمو سطح الخلية (كمؤشر على قوة تمدد الخلية لخلية معينة وللخلايا الوليدة عند الانقسام) وخرائط تباين النمو، التي تقيس اتجاه تمدد الخلايا (تُستخدم أيضًا هنا لخلية معينة وللخلايا الوليدة عند الانقسام؛ الشكل 5أ، ب، انظر الطرق والطرق التكميلية). تتوافق خرائطنا لمعدل نمو سطح خلية SAM مع الملاحظات السابقة38،39، حيث توجد معدلات نمو دنيا عند الحدود ومعدلات نمو قصوى في الأزهار النامية (الشكل 5أ). أظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) أن نشاط إشارات GA كان مرتبطًا سلبًا بكثافة نمو سطح الخلية (الشكل 5ج). كما أظهرنا أن محاور التباين الرئيسية، بما في ذلك مدخلات إشارات GA وكثافة النمو، كانت متعامدة مع الاتجاه الذي يحدده ارتفاع التعبير عن CLV3، مما يؤكد استبعاد الخلايا من مركز SAM في التحليلات المتبقية. أكد تحليل ارتباط سبيرمان نتائج PCA (الشكل 5د)، مشيرًا إلى أن إشارات GA الأعلى في IPR لم تُسفر عن تمدد خلوي أكبر. ومع ذلك، كشف تحليل الارتباط عن وجود ارتباط إيجابي طفيف بين نشاط إشارات GA وتباين النمو (الشكل 5ج، د)، مما يشير إلى أن إشارات GA الأعلى في IPR تؤثر على اتجاه نمو الخلية، وربما على موقع مستوى انقسام الخلية.
أ، ب خرائط حرارية لمتوسط ​​نمو السطح (أ) وتباين النمو (ب) في SAM تم حساب متوسطها على سبعة نباتات مستقلة (تستخدم كبدائل لقوة واتجاه تمدد الخلايا، على التوالي). ج شمل تحليل PCA المتغيرات التالية: إشارة GA، وكثافة نمو السطح، وتباين نمو السطح، وتعبير CLV3. ارتبط المكون 1 من PCA بشكل سلبي بشكل رئيسي بكثافة نمو السطح وارتبط بشكل إيجابي بإشارة GA. ارتبط المكون 2 من PCA بشكل إيجابي بشكل رئيسي بتباين نمو السطح وارتبط بشكل سلبي بتعبير CLV3. تمثل النسب المئوية التباين الذي يفسره كل مكون. د تحليل ارتباط سبيرمان بين إشارة GA وكثافة نمو السطح وتباين نمو السطح على مقياس الأنسجة باستثناء CZ. الرقم الموجود على اليمين هو قيمة سبيرمان رو بين متغيرين. تشير العلامات النجمية إلى الحالات التي يكون فيها الارتباط/الارتباط السلبي مهمًا للغاية. هـ تصور ثلاثي الأبعاد لخلايا Col-0 SAM L1 بواسطة المجهر البؤري. جدران الخلايا الجديدة المتكونة في SAM (وليس البُدائِيَّة) عند 10 ساعات مُلوَّنة وفقًا لقيم زواياها. يظهر شريط الألوان في الزاوية السفلية اليمنى. يُظهر المُلحق الصورة ثلاثية الأبعاد المُناظرة عند 0 ساعة. أُعيدت التجربة مرتين بنتائج مُماثلة. تُظهر الرسوم البيانية الصندوقية معدلات انقسام الخلايا في IPR وColon-0 SAM غير IPR (ن = 10 نباتات مُستقلة). يُظهر خط المنتصف المتوسط، وتُشير حدود الصندوق إلى النسبتين المئويتين 25 و75. تُشير الشعيرات إلى الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم المُحددة باستخدام برنامج R. تم الحصول على قيم P باستخدام اختبار t ثنائي الذيل لـ Welch. g، h مخطط تخطيطي يوضح (ز) كيفية قياس زاوية جدار الخلية الجديد (أرجواني) بالنسبة للاتجاه الشعاعي من مركز SAM (خط منقط أبيض) (يتم اعتبار قيم الزاوية الحادة فقط، أي 0-90 درجة)، و (ح) الاتجاهات المحيطية/الجانبية والشعاعية داخل النسيج الإنشائي. i مخططات تكرارية لاتجاه مستوى انقسام الخلية عبر SAM (أزرق داكن)، وIPR (أزرق متوسط)، وغير IPR (أزرق فاتح)، على التوالي. تم الحصول على قيم P بواسطة اختبار Kolmogorov-Smirnov ثنائي الذيل. تكررت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. j مخططات تكرارية لاتجاه مستوى انقسام الخلية لـ IPR حول P3 (أخضر فاتح)، وP4 (أخضر متوسط)، وP5 (أخضر داكن)، على التوالي. تم الحصول على قيم P بواسطة اختبار Kolmogorov-Smirnov ثنائي الذيل. تكررت التجربة مرتين بنتائج مماثلة.
لذلك، بحثنا بعد ذلك في العلاقة بين إشارات حمض الغلوتاميك ونشاط انقسام الخلايا من خلال تحديد جدران الخلايا حديثة التكوين أثناء الاختبار (الشكل 5هـ). سمح لنا هذا النهج بقياس وتيرة واتجاه انقسام الخلايا. ومن المثير للدهشة أننا وجدنا أن وتيرة انقسامات الخلايا في IPR وبقية خلايا SAM (غير IPR، الشكل 5و) كانت متشابهة، مما يشير إلى أن الاختلافات في إشارات حمض الغلوتاميك بين خلايا IPR والخلايا غير IPR لا تؤثر بشكل كبير على انقسام الخلايا. هذا، بالإضافة إلى الارتباط الإيجابي بين إشارات حمض الغلوتاميك وتباين النمو، دفعنا إلى النظر فيما إذا كان نشاط إشارات حمض الغلوتاميك يمكن أن يؤثر على اتجاه مستوى انقسام الخلايا. قمنا بقياس اتجاه جدار الخلية الجديد كزاوية حادة بالنسبة للمحور الشعاعي الذي يربط مركز النسيج الإنشائي ومركز جدار الخلية الجديد (الشكل 5هـ-ط)، ولاحظنا ميلًا واضحًا للخلايا للانقسام بزوايا قريبة من 90 درجة بالنسبة للمحور الشعاعي، مع ملاحظة أعلى ترددات عند 70-80 درجة (23.28%) و80-90 درجة (22.62%) (الشكل 5هـ،ط)، وهو ما يتوافق مع انقسامات الخلايا في الاتجاه المحيطي/العرضي (الشكل 5ح). لدراسة مساهمة إشارات الحمض النووي الريبوزي في سلوك انقسام الخلايا هذا، قمنا بتحليل معلمات انقسام الخلايا في كل من IPR وغير IPR بشكل منفصل (الشكل 5ط). لاحظنا أن توزيع زاوية الانقسام في خلايا IPR يختلف عن توزيعها في الخلايا غير IPR أو في الخلايا في SAM بأكملها، حيث أظهرت خلايا IPR نسبة أعلى من الانقسامات الخلوية الجانبية/الدائرية، أي 70-80 درجة و80-90 درجة (33.86٪ و30.71٪، على التوالي، النسب المقابلة) (الشكل 5i). وبالتالي، كشفت ملاحظاتنا عن وجود ارتباط بين إشارات GA العالية واتجاه مستوى انقسام الخلية بالقرب من الاتجاه المحيطي، على غرار الارتباط بين نشاط إشارات GA وتباين النمو (الشكل 5 ج، د). ولإثبات الحفاظ المكاني لهذا الارتباط بشكل أكبر، قمنا بقياس اتجاه مستوى الانقسام في خلايا IPR المحيطة بالبادئة بدءًا من P3، حيث تم اكتشاف أعلى نشاط لإشارات GA في هذه المنطقة بدءًا من P4 (الشكل 4). لم تُظهر زوايا انقسام IPR حول P3 وP4 أي فروق ذات دلالة إحصائية، على الرغم من ملاحظة زيادة في تواتر الانقسامات الخلوية الجانبية في IPR حول P4 (الشكل 5j). ومع ذلك، في خلايا IPR حول P5، أصبح الاختلاف في اتجاه مستوى انقسام الخلايا ذا دلالة إحصائية، مع زيادة حادة في تواتر الانقسامات الخلوية العرضية (الشكل 5j). تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى أن إشارات GA يمكنها التحكم في اتجاه انقسامات الخلايا في SAM، وهو ما يتوافق مع التقارير السابقة40،41 التي تفيد بأن إشارات GA العالية يمكن أن تُحفز الاتجاه الجانبي لانقسامات الخلايا في IPR.
من المتوقع ألا تندمج الخلايا في منطقة IPR في البدائيات، بل في العقد الداخلية (2،42،43). قد يؤدي التوجه العرضي لانقسامات الخلايا في منطقة IPR إلى التنظيم النموذجي لصفوف طولية متوازية من خلايا البشرة في العقد الداخلية. تشير ملاحظاتنا المذكورة أعلاه إلى أن إشارات الحمض النووي الريبوزي (GA) تلعب دورًا على الأرجح في هذه العملية من خلال تنظيم اتجاه انقسام الخلايا.
يؤدي فقدان وظيفة العديد من جينات DELLA إلى استجابة تكوينية لـ GA، ويمكن استخدام طفرات della لاختبار هذه الفرضية44. قمنا أولاً بتحليل أنماط التعبير لخمسة جينات DELLA في SAM. كشف الاندماج النسخي لخط GUS45 أن GAI وRGA وRGL1 وRGL2 (بدرجة أقل بكثير) تم التعبير عنها في SAM (الشكل التكميلي 11أ-د). أظهر التهجين الموضعي أيضًا أن mRNA لـ GAI يتراكم بشكل خاص في البُدايات والأزهار النامية (الشكل التكميلي 11هـ). تم اكتشاف mRNA لـ RGL1 وRGL3 في جميع أنحاء مظلة SAM وفي الزهور القديمة، بينما كان mRNA لـ RGL2 أكثر وفرة في المنطقة الحدودية (الشكل التكميلي 11و-ح). أكد التصوير البؤري لـ pRGL3::RGL3-GFP SAM التعبيرَ المُلاحظَ بالتهجين الموضعي، وأظهر أن بروتين RGL3 يتراكم في الجزء المركزي من SAM (الشكل التكميلي 11i). باستخدام خط pRGA::GFP-RGA، وجدنا أيضًا أن بروتين RGA يتراكم في SAM، لكن كثافته تتناقص عند الحدود بدءًا من P4 (الشكل التكميلي 11j). والجدير بالذكر أن أنماط التعبير لـ RGL3 وRGA تتوافق مع ارتفاع نشاط إشارات GA في IPR، كما تم الكشف عنه بواسطة qmRGA (الشكل 4). علاوة على ذلك، تشير هذه البيانات إلى أن جميع DELLA مُعبَّر عنها في SAM، وأن تعبيرها يمتد مجتمعًا عبر SAM بأكمله.
قمنا بعد ذلك بتحليل معاملات انقسام الخلايا في طفرات SAM من النوع البري (Ler، المجموعة الضابطة) وطفرات della quintuple (العالمية) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 (الشكل 6أ، ب). ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا تحولًا ذا دلالة إحصائية في توزيع ترددات زوايا انقسام الخلايا في طفرات della العالمية مقارنةً بالنوع البري (الشكل 6ج). يُعزى هذا التغير في طفرات della العالمية إلى زيادة في تردد زوايا 80-90 درجة (34.71% مقابل 24.55%)، وبدرجة أقل، زوايا 70-80 درجة (23.78% مقابل 20.18%)، أي ما يُقابل الانقسامات الخلوية العرضية (الشكل 6ج). كان معدل الانقسامات غير المستعرضة (0-60 درجة) أقل أيضًا في الطفرة العالمية ديلا (الشكل 6ج). زاد معدل الانقسامات الخلوية المستعرضة بشكل ملحوظ في SAM للطفرة العالمية ديلا (الشكل 6ب). كان معدل الانقسامات الخلوية المستعرضة في IPR أعلى أيضًا في الطفرة العالمية ديلا مقارنةً بالنوع البري (الشكل 6د). خارج منطقة IPR، كان للنوع البري توزيع أكثر اتساقًا لزوايا انقسام الخلايا، بينما فضلت الطفرة العالمية ديلا الانقسامات الظاهرية مثل IPR (الشكل 6هـ). كما قمنا أيضًا بقياس اتجاه انقسامات الخلايا في SAM للطفرات الخماسية لأوكسيديز ga2 (ga2ox) (ga2ox1-1 وga2ox2-1 وga2ox3-1 وga2ox4-1 وga2ox6-2)، وهي خلفية طفرة غير نشطة للحمض الغليكوزيلاتي يتراكم فيها الحمض الغليكوزيلاتي. بالتوافق مع زيادة مستويات حمض الغلوتاميك، كان حجم جزيء SAM في النورة الطافرة ga2ox الخماسية أكبر من حجم جزيء Col-0 (الشكل التكميلي 12أ، ب). وبالمقارنة مع Col-0، أظهر جزيء SAM الخماسي ga2ox توزيعًا مختلفًا تمامًا لزوايا انقسام الخلايا، حيث ازداد تردد الزاوية من 50 درجة إلى 90 درجة، أي أنه يُفضّل الانقسامات العرضية (الشكل التكميلي 12أ-ج). وبالتالي، نُبيّن أن التنشيط التكويني لإشارات حمض الغلوتاميك وتراكمه يُحفّزان الانقسامات الجانبية للخلايا في IPR وبقية جزيء SAM.
أ، ب تصور ثلاثي الأبعاد لطبقة L1 من Ler (أ) الملطخة بـ PI وSAM الطافرة الشاملة (ب) باستخدام المجهر البؤري. تظهر جدران الخلايا الجديدة المتكونة في SAM (ولكن ليس البدائية) على مدى فترة 10 ساعات ويتم تلوينها وفقًا لقيم زاويةها. يوضح الشكل المدرج SAM عند 0 ساعة. يتم عرض شريط الألوان في الزاوية اليمنى السفلية. يشير السهم الموجود في (ب) إلى مثال لملفات الخلايا المحاذية في طفرة della الشاملة. تكررت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. مقارنة توزيع ترددات اتجاهات مستوى انقسام الخلايا في SAM بالكامل (د) وIPR (هـ) وغير IPR (و) بين Ler وديلا الشاملة. تم الحصول على قيم P باستخدام اختبار Kolmogorov-Smirnov ثنائي الذيل. و، ز، تصور ثلاثي الأبعاد لصور بؤرية لعينة SAM مصبوغة بـ PI لنباتات Col-0 (i) وpCUC2::gai-1-VENUS (j) المعدلة وراثيًا. تُظهر اللوحات (أ، ب) جدرانًا خلوية جديدة (ولكن ليس البدائيات) تكوّنت في عينة SAM خلال 10 ساعات. كُررت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. ح-ج، مقارنة توزيع ترددات اتجاهات مستوى انقسام الخلايا في عينة SAM بأكملها (ح)، وIPR (i)، وغير IPR (j) بين نباتات Col-0 وpCUC2::gai-1-VENUS. تم الحصول على القيم الاحتمالية باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف ثنائي الذيل.
بعد ذلك، اختبرنا تأثير تثبيط إشارات GA تحديدًا في IPR. ولتحقيق ذلك، استخدمنا مُحفِّز الكأس الفلقية 2 (CUC2) لتحفيز التعبير عن بروتين gai-1 السالب السائد المُلتحم بـ VENUS (في سلالة pCUC2::gai-1-VENUS). في سلالة SAM البرية، يُحفِّز مُحفِّز CUC2 التعبير عن معظم IPRs في SAM، بما في ذلك الخلايا الحدودية، بدءًا من P4 فصاعدًا، ولوحظ تعبير مُحدَّد مُماثل في نباتات pCUC2::gai-1-VENUS (انظر أدناه). لم يختلف توزيع زوايا انقسام الخلايا عبر SAM أو IPR لنباتات pCUC2::gai-1-VENUS اختلافًا كبيرًا عن توزيعها في السلالة البرية، على الرغم من أننا وجدنا، بشكل غير متوقع، أن الخلايا التي لا تحتوي على IPR في هذه النباتات انقسمت بتردد أعلى يتراوح بين 80 و90 درجة (الشكل 6f-j).
أُشير إلى أن اتجاه انقسام الخلايا يعتمد على هندسة SAM، وخاصةً إجهاد الشد الناتج عن انحناء الأنسجة46. لذلك، تساءلنا عما إذا كان شكل SAM قد تغير في نباتات الطفرة العالمية della وpCUC2::gai-1-VENUS. وكما ذُكر سابقًا12، كان حجم SAM للطفرة العالمية della أكبر من حجمه في النوع البري (الشكل التكميلي 13أ، ب، د). أكد التهجين الموضعي لـ CLV3 وRNA STM تمدد النسيج الإنشائي في طفرات della، وأظهر أيضًا التمدد الجانبي لمكانة الخلية الجذعية (الشكل التكميلي 13هـ، و، ح، ط). ومع ذلك، كان انحناء SAM متشابهًا في كلا النمطين الجينيين (الشكل التكميلي 13ك، م، ن، ع). لاحظنا زيادة مماثلة في الحجم في الطفرة الرباعية gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della دون تغيير في الانحناء مقارنةً بالنوع البري (الشكل التكميلي 13ج، د، ز، ي، ل، ع). تأثر أيضًا تواتر اتجاه انقسام الخلايا في الطفرة الرباعية della، ولكن بدرجة أقل من الطفرة المتجانسة della (الشكل التكميلي 12د-و). يشير تأثير الجرعة هذا، إلى جانب عدم وجود تأثير على الانحناء، إلى أن نشاط RGL3 المتبقي في الطفرة الرباعية Della يحد من تغيرات اتجاه انقسام الخلايا الناتجة عن فقدان نشاط DELLA، وأن التغيرات في الانقسامات الجانبية للخلايا تحدث استجابةً لتغيرات في نشاط إشارات GA وليس تغيرات في هندسة SAM. كما هو موضح سابقًا، يُحفّز مُحفّز CUC2 تعبير IPR في SAM بدءًا من P4 (الشكل التكميلي 14أ، ب)، وفي المقابل، كان حجم pCUC2::gai-1-VENUS SAM أصغر لكن انحناءه أعلى (الشكل التكميلي 14ج-ح). قد يُؤدي هذا التغيير في مورفولوجيا pCUC2::gai-1-VENUS SAM إلى توزيع مختلف للإجهادات الميكانيكية مقارنةً بالنوع البري، حيث تبدأ الإجهادات المحيطية العالية على مسافة أقصر من مركز SAM47. ومن ناحية أخرى، قد تنتج التغيرات في مورفولوجيا pCUC2::gai-1-VENUS SAM عن تغيرات في الخواص الميكانيكية الإقليمية المُحفّزة بتعبير الجينات المُتحوِّرة48. في كلتا الحالتين، قد يُعوّض هذا جزئيًا آثار التغيرات في إشارات GA عن طريق زيادة احتمالية انقسام الخلايا في الاتجاه المحيطي/العرضي، مما يُفسّر ملاحظاتنا.
عند النظر إليها مجتمعةً، تؤكد بياناتنا أن إشارات GA الأعلى تلعب دورًا فعالًا في الاتجاه الجانبي لمستوى انقسام الخلية في IPR. كما تُظهر أن انحناء النسيج الإنشائي يؤثر أيضًا على اتجاه مستوى انقسام الخلية في IPR.
يشير التوجه العرضي لمستوى الانقسام في IPR، نتيجةً لنشاط إشارات GA العالي، إلى أن GA يُنظّم مسبقًا ملفًا خلويًا شعاعيًا في البشرة داخل SAM لتحديد التنظيم الخلوي الذي سيُكتشف لاحقًا في العقدة الداخلية للبشرة. في الواقع، كانت هذه الملفات الخلوية مرئيةً بشكل متكرر في صور SAM للطفرات الشاملة ديلا (الشكل 6ب). لذلك، لاستكشاف الوظيفة التطورية للنمط المكاني لإشارات GA في SAM بشكل أعمق، استخدمنا التصوير الفاصل الزمني لتحليل التنظيم المكاني للخلايا في IPR في النباتات البرية (Ler وCol-0)، والطفرات الشاملة ديلا، والنباتات المعدلة وراثيًا pCUC2::gai-1-VENUS.
وجدنا أن qmRGA أظهر أن نشاط إشارات GA في IPR زاد من P1/P2 وبلغ ذروته عند P4، وظل هذا النمط ثابتًا بمرور الوقت (الشكل 4أ-و والشكل التكميلي 8ج-و، ك). لتحليل التنظيم المكاني للخلايا في IPR مع زيادة إشارة GA، قمنا بتسمية خلايا Ler IPR أعلى وجوانب P4 وفقًا لمصيرها التنموي الذي تم تحليله بعد 34 ساعة من الملاحظة الأولى، أي أكثر من مرتين في البلاستيد، مما يسمح لنا بتتبع خلايا IPR أثناء تطور البدائية من P1/P2 إلى P4. استخدمنا ثلاثة ألوان مختلفة: الأصفر لتلك الخلايا التي تم دمجها في البدائية بالقرب من P4، والأخضر لتلك التي كانت في IPR، والأرجواني لتلك التي شاركت في كلتا العمليتين (الشكل 7أ-ج). عند t0 (0 ساعة)، كانت 1-2 طبقة من خلايا IPR مرئية أمام P4 (الشكل 7أ). كما هو متوقع، انقسمت هذه الخلايا بشكل رئيسي عبر مستوى الانقسام العرضي (الشكلان 7أ-ج). وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام Col-0 SAM (مع التركيز على P3، الذي تشبه طيات حدوده طيات P4 في Ler)، على الرغم من أن الطية المتكونة عند حدود الزهرة في هذا النمط الجيني أخفت خلايا IPR بسرعة أكبر (الشكل 7ز-ط). وبالتالي، فإن نمط انقسام خلايا IPR يُنظم الخلايا مسبقًا في صفوف شعاعية، كما هو الحال في العقديات. ويشير تنظيم الصفوف الشعاعية وموقع خلايا IPR بين الأعضاء المتعاقبة إلى أن هذه الخلايا هي أسلاف عقدية.
هنا، قمنا بتطوير مستشعر بيولوجي لإشارات حمض الغلوتاميك النسبي، qmRGA، يسمح برسم خرائط كمية لنشاط إشارات حمض الغلوتاميك الناتج عن تركيزات مُركبة من حمض الغلوتاميك ومستقبلات حمض الغلوتاميك، مع تقليل التداخل مع مسارات الإشارات الداخلية، مما يوفر معلومات عن وظيفة حمض الغلوتاميك على المستوى الخلوي. ولتحقيق هذه الغاية، قمنا ببناء بروتين DELLA مُعدّل، mRGA، فقد قدرته على الارتباط بشركاء تفاعل DELLA، ولكنه لا يزال حساسًا للتحلل البروتيني المُستحث بواسطة حمض الغلوتاميك. يستجيب qmRGA للتغيرات الخارجية والداخلية في مستويات حمض الغلوتاميك، وتُمكّن خصائصه الاستشعارية الديناميكية من تقييم التغيرات المكانية والزمانية في نشاط إشارات حمض الغلوتاميك أثناء النمو. كما يُعد qmRGA أداة مرنة للغاية، إذ يُمكن تكييفه مع أنسجة مختلفة عن طريق تغيير المُحفّز المُستخدم للتعبير عنه (عند الضرورة)، ونظرًا للطبيعة المُحافظة لمسار إشارات حمض الغلوتاميك ونمط PFYRE في كاسيات البذور، فمن المُرجّح أن يكون قابلاً للنقل إلى أنواع أخرى.22 تماشيًا مع ذلك، تبيّن أيضًا أن طفرةً مكافئةً في بروتين الأرز SLR1 DELLA (HYY497AAA) تُثبِّط نشاط SLR1 الكابت للنمو، مع تقليل تحلله بوساطة GA بشكلٍ طفيف، على غرار mRGA23. والجدير بالذكر أن دراساتٍ حديثةً على نبات الأرابيدوبسيس أظهرت أن طفرةً في حمضٍ أمينيٍّ واحدٍ في نطاق PFYRE (S474L) غيّرت النشاط النسخي لـ RGA دون التأثير على قدرته على التفاعل مع شركاء عوامل النسخ50. وعلى الرغم من أن هذه الطفرة قريبةٌ جدًا من استبدالات الأحماض الأمينية الثلاثة الموجودة في mRGA، إلا أن دراساتنا تُظهر أن هاتين الطفرتين تُغيِّران خصائصَ مميزةً لـ DELLA. ورغم أن معظم شركاء عوامل النسخ يرتبطون بنطاقي LHR1 وSAW في DELLA26،51، إلا أن بعض الأحماض الأمينية المحفوظة في نطاق PFYRE قد تُساعد في استقرار هذه التفاعلات.
يُعد تطور العقد الداخلية سمة أساسية في بنية النبات وتحسين الغلة. وقد أظهر qmRGA نشاطًا أعلى لإشارات GA في الخلايا السلفية للعقد الداخلية لـ IPR. ومن خلال الجمع بين التصوير الكمي وعلم الوراثة، أظهرنا أن أنماط إشارات GA تتراكب على مستويات انقسام الخلايا الدائرية/العرضية في بشرة SAM، مما يُشكل تنظيم انقسام الخلايا اللازم لتطور العقد الداخلية. وقد تم تحديد العديد من منظمات اتجاه مستوى انقسام الخلايا أثناء التطور52،53. ويقدم عملنا مثالًا واضحًا على كيفية تنظيم نشاط إشارات GA لهذه المعلمة الخلوية. يمكن أن يتفاعل DELLA مع معقدات البروتين مسبقة الطي41، لذا قد تنظم إشارات GA اتجاه مستوى انقسام الخلايا من خلال التأثير المباشر على اتجاه الأنابيب الدقيقة القشرية40،41،54،55. وقد أظهرنا بشكل غير متوقع أنه في SAM، لم يكن ارتباط نشاط إشارات GA المرتفع هو استطالة الخلية أو انقسامها، بل كان فقط تباين النمو، وهو ما يتوافق مع التأثير المباشر لـ GA على اتجاه انقسام الخلايا في IPR. مع ذلك، لا يمكننا استبعاد أن يكون هذا التأثير غير مباشر أيضًا، على سبيل المثال، نتيجةً لتليين جدار الخلية المُحفَّز بالحمض الغلوتاميكي 56. تُحفِّز التغيرات في خصائص جدار الخلية إجهادًا ميكانيكيًا 57،58، والذي قد يؤثر أيضًا على اتجاه مستوى انقسام الخلية من خلال التأثير على اتجاه الأنابيب الدقيقة القشرية 39،46،59. قد يكون للتأثيرات المُجتمعة للإجهاد الميكانيكي المُحفَّز بالحمض الغلوتاميكي والتنظيم المُباشر لاتجاه الأنابيب الدقيقة بواسطة الحمض الغلوتاميكي دورٌ في توليد نمط مُحدد لاتجاه انقسام الخلايا في منطقة IPR لتحديد العقد، وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاختبار هذه الفكرة. وبالمثل، سلَّطت دراسات سابقة الضوء على أهمية بروتيني TCP14 و15 المُتفاعلين مع DELLA في التحكم في تكوين العقد 60،61، وقد تُؤثِّر هذه العوامل على عمل الحمض الغلوتاميكي مع بروتيني BREVIPEDICELLUS (BP) وPENNYWISE (PNY)، اللذين يُنظِّمان نمو العقد، وقد ثَبُتَ أنهما يُؤثِّران على إشارات الحمض الغلوتاميكي 2،62. ونظرًا لأن DELLAs تتفاعل مع مسارات إشارات البراسينوستيرويد والإيثيلين وحمض الجاسمونيك وحمض الأبسيسيك (ABA)63،64 وأن هذه الهرمونات يمكن أن تؤثر على اتجاه الأنابيب الدقيقة65، فإن تأثيرات GA على اتجاه انقسام الخلايا قد تكون أيضًا بواسطة هرمونات أخرى.
أظهرت الدراسات الخلوية المبكرة أن كلا المنطقتين الداخلية والخارجية من نسيج SAM في نبات أرابيدوبسيس ضروريتان لنمو العقد الداخلية2،42. ويدعم تنظيم حمض الجبريليك النشط لانقسام الخلايا في الأنسجة الداخلية12 وظيفة مزدوجة لحمض الجبريليك في تنظيم حجم النسيج الإنشائي والعقد الداخلية في نسيج SAM. كما أن نمط انقسام الخلايا الاتجاهي منظم بدقة في نسيج SAM الداخلي، وهذا التنظيم ضروري لنمو الجذع52. وسيكون من المثير للاهتمام دراسة ما إذا كان حمض الجبريليك يلعب أيضًا دورًا في توجيه مستوى انقسام الخلايا في تنظيم نسيج SAM الداخلي، وبالتالي مزامنة تحديد وتطور العقد الداخلية داخل نسيج SAM.
زُرعت النباتات في المختبر في التربة أو وسط موراشيج-سكوج (MS) واحد (Duchefa) مُضافًا إليه ١٪ سكروز و١٪ أجار (Sigma) في ظل ظروف قياسية (١٦ ساعة ضوء، ٢٢ درجة مئوية)، باستثناء تجارب نمو الهايبوكوتيل والجذور التي زُرعت فيها الشتلات على ألواح رأسية تحت ضوء ثابت و٢٢ درجة مئوية. أما بالنسبة لتجارب النترات، فقد زُرعت النباتات في وسط MS مُعدّل (وسط bioWORLD النباتي) مُضافًا إليه كمية مناسبة من النترات (٠ أو ١٠ ملي مولار من KNO3)، و٠.٥ ملي مولار من سكسينات الأمونيوم، و١٪ سكروز، و١٪ أجار (Sigma) في ظل ظروف النهار الطويل.
أُعيد دمج جين GID1a cDNA المُدرج في pDONR221 مع جين pDONR P4-P1R-pUBQ10 وجين pDONR P2R-P3-mCherry في pB7m34GW لتوليد pUBQ10::GID1a-mCherry. أُعيد دمج جين IDD2 DNA المُدرج في pDONR221 في pB7RWG266 لتوليد p35S:IDD2-RFP. لتوليد pGID1b::2xmTQ2-GID1b، تم تضخيم جزء 3.9 كيلو بايت أعلى منطقة ترميز GID1b وجزء 4.7 كيلو بايت يحتوي على cDNA GID1b (1.3 كيلو بايت) والمنتهي (3.4 كيلو بايت) أولاً باستخدام البادئات في الجدول التكميلي 3 ثم تم إدخالها في pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) وpDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific)، على التوالي، وأخيرًا تم إعادة دمجها مع pDONR221 2xmTQ268 في متجه الهدف pGreen 012567 باستخدام استنساخ Gateway. لتوليد pCUC2::LSSmOrange، جُمعت تسلسلات مُحفِّز CUC2 (3229 زوجًا قاعديًا أعلى من ATG) متبوعةً بتسلسل ترميز mOrange كبير الحجم مُزاح بستوكس (LSSmOrange)69 مع إشارة توطين النواة N7 ومُنهي النسخ NOS في ناقل استهداف الكانامايسين pGreen باستخدام نظام إعادة التركيب ثلاثي الأجزاء Gateway (Invitrogen). أُدخل الناقل الثنائي النباتي في سلالة Agrobacterium tumefaciens GV3101، وفي أوراق Nicotiana benthamiana بطريقة تسلل Agrobacterium، وفي Arabidopsis thaliana Col-0 بطريقة الغمس الزهري، على التوالي. عُزل pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry وpCLV3::mCherry-NLS qmRGA من ذريتي F3 وF1 من التهجينات المعنية، على التوالي.
أُجري تهجين الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (RNA) في الموقع على أطراف براعم بطول 1 سم تقريبًا72، جُمعت وثُبّتت فورًا في محلول FAA (3.7% فورمالدهيد، 5% حمض أسيتيك، 50% إيثانول) مُبرّد مسبقًا إلى 4 درجات مئوية. بعد معالجتين بالتفريغ لمدة 15 دقيقة، غُيّر المُثبّت وحُضّنت العينات طوال الليل. صُنعت الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين التكميلي (cDNA) لـ GID1a وGID1b وGID1c وGAI وRGL1 وRGL2 وRGL3، بالإضافة إلى مجسات مضادة للجينات في المنطقة غير المترجمة 3'-UTRs باستخدام البادئات الموضحة في الجدول التكميلي 3، كما وصفها روزير وآخرون73. تم الكشف عن المجسات الموسومة بالديجوكسيجينين مناعيًا باستخدام أجسام مضادة للديجوكسيجينين (تخفيف 3000 ضعف؛ Roche، رقم الكتالوج: 11 093 274 910)، وتم صبغ المقاطع بمحلول 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات (BCIP، تخفيف 250 ضعف) / نيترو بلو تيترازوليوم (NBT، تخفيف 200 ضعف).