يكشف المستشعر الحيوي الكمي للجبريلين عن دور الجبريلينات في تحديد السلاميات في المرستيم القمي للساق

يُعد نمو النسيج الإنشائي القمي للساق (SAM) أمرًا بالغ الأهمية لبنية الساق. الهرمونات النباتيةالجبريليناتتلعب الجبريلينات (GAs) أدوارًا محورية في تنسيق نمو النبات، إلا أن دورها في النسيج المرستيمي القمي للساق (SAM) لا يزال غير مفهوم بشكل كافٍ. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير مستشعر حيوي نسبي لإشارات الجبريلينات عن طريق هندسة بروتين DELLA لكبح وظيفته التنظيمية الأساسية في الاستجابة النسخية للجبريلينات مع الحفاظ على تحلله عند التعرف عليه. وقد أثبتنا أن هذا المستشعر الحيوي القائم على التحلل يسجل بدقة التغيرات في مستويات الجبريلينات والاستشعار الخلوي أثناء النمو. استخدمنا هذا المستشعر الحيوي لرسم خريطة نشاط إشارات الجبريلينات في النسيج المرستيمي القمي للساق. وأظهرنا أن إشارات الجبريلينات العالية تتواجد بشكل رئيسي في الخلايا الواقعة بين براعم الأعضاء، وهي الخلايا السلفية للخلايا السلامية. وباستخدام أساليب زيادة ونقص الوظيفة، أثبتنا كذلك أن الجبريلينات تنظم اتجاه مستوى انقسام الخلية، مما يُرسي التنظيم الخلوي المتعارف عليه للخلايا السلامية، وبالتالي يعزز تحديد الخلايا السلامية في النسيج المرستيمي القمي للساق.
تحتوي القمة النامية للساق (SAM)، الموجودة في قمة الساق، على بيئة من الخلايا الجذعية التي تُنتج أعضاءً جانبية وعُقدًا ساقية بطريقة نمطية وتكرارية طوال دورة حياة النبات. تتضمن كل وحدة من هذه الوحدات المتكررة، أو عُقد النبات، سلاميات وأعضاءً جانبية عند العُقد، بالإضافة إلى مرستيمات إبطية في آباط الأوراق. يتغير نمو وتنظيم عُقد النبات أثناء مراحل النمو. في نبات الرشاد، يتوقف نمو السلاميات خلال المرحلة الخضرية، وتبقى المرستيمات الإبطية كامنة في آباط أوراق الوردة. خلال الانتقال إلى المرحلة الزهرية، تتحول القمة النامية للساق إلى مرستيم النورة، مُنتجةً سلاميات مُستطيلة وبراعم إبطية، وفروعًا صغيرة في آباط أوراق الساق، ولاحقًا، أزهارًا عديمة الأوراق. على الرغم من أننا أحرزنا تقدماً كبيراً في فهم الآليات التي تتحكم في بدء تكوين الأوراق والزهور والفروع، إلا أن المعلومات المتوفرة حول كيفية نشوء السلاميات قليلة نسبياً.
يُساعد فهم التوزيع المكاني والزماني للجبريلينات على فهم وظائف هذه الهرمونات بشكل أفضل في مختلف الأنسجة وفي مراحل النمو المختلفة. يوفر تصوير تحلل بروتين RGA-GFP المدمج، المُعبَّر عنه تحت تأثير مُحفِّزه الخاص، معلومات مهمة حول تنظيم مستويات الجبريلين الكلية في الجذور^15،16. مع ذلك، يختلف تعبير RGA بين الأنسجة¹⁷، ويخضع لتنظيم الجبريلين¹⁸. لذا، قد يؤدي التعبير التفاضلي لمُحفِّز RGA إلى نمط التألق المُلاحظ مع RGA-GFP، وبالتالي فإن هذه الطريقة ليست كمية. في الآونة الأخيرة، كشف الجبريلين المُوسَم بالفلوريسين النشط بيولوجيًا^19،20 عن تراكم الجبريلين في القشرة الداخلية للجذر، وتنظيم مستوياته الخلوية عن طريق نقل الجبريلين. كما أظهر مُستشعر نقل طاقة الرنين الفلوري للجبريلين nlsGPS1 مؤخرًا أن مستويات الجبريلين ترتبط باستطالة الخلايا في الجذور والخيوط وتحت الفلقات النامية في الظلام²¹. مع ذلك، وكما رأينا، فإن تركيز حمض الجبريليك (GA) ليس العامل الوحيد المتحكم في نشاط إشاراته، إذ يعتمد على عمليات استشعار معقدة. هنا، وانطلاقًا من فهمنا لمسارات إشارات DELLA وGA، نقدم تطوير وتوصيف مستشعر حيوي نسبي قائم على التحلل لقياس إشارات GA. ولتطوير هذا المستشعر الكمي، استخدمنا بروتين RGA طافرًا حساسًا لـGA، مُدمجًا مع بروتين فلوري، ويُعبر عنه بشكل واسع في الأنسجة، بالإضافة إلى بروتين فلوري غير حساس لـGA. نُبين أن بروتينات RGA الطافرة المدمجة لا تتداخل مع إشارات GA الداخلية عند التعبير عنها بشكل واسع، وأن هذا المستشعر الحيوي قادر على قياس نشاط الإشارات الناتج عن كلٍ من مدخلات GA ومعالجة إشارات GA بواسطة جهاز الاستشعار بدقة مكانية وزمانية عالية. استخدمنا هذا المستشعر الحيوي لرسم خريطة التوزيع المكاني والزماني لنشاط إشارات حمض الجبريليك (GA) وتحديد كيفية تنظيمه للسلوك الخلوي في بشرة النسيج المرستيمي القمي للساق (SAM). وقد أظهرنا أن حمض الجبريليك ينظم اتجاه مستوى انقسام خلايا النسيج المرستيمي القمي للساق الواقعة بين براعم الأعضاء، وبالتالي يحدد التنظيم الخلوي المتعارف عليه للعقدة.
أخيرًا، تساءلنا عما إذا كان بإمكان qmRGA رصد التغيرات في مستويات الجبريلين الداخلي باستخدام السويقات النامية. وقد أظهرنا سابقًا أن النترات تحفز النمو عن طريق زيادة تخليق الجبريلين، وبالتالي تحلل بروتين DELLA34. وبناءً على ذلك، لاحظنا أن طول السويقة في بادرات pUBQ10::qmRGA النامية في ظل وفرة النترات (10 ملي مولار NO3−) كان أطول بشكل ملحوظ من طولها في البادرات النامية في ظل نقص النترات (الشكل التكميلي 6أ). وتماشيًا مع استجابة النمو، كانت إشارات الجبريلين أعلى في سويقات البادرات النامية في ظل تركيز 10 ملي مولار NO3− مقارنةً بالبادرات النامية في غياب النترات (الشكل التكميلي 6ب، ج). وبالتالي، يُمكّن qmRGA أيضًا من رصد التغيرات في إشارات الجبريلين الناتجة عن التغيرات الداخلية في تركيز الجبريلين.
لفهم ما إذا كان نشاط إشارات الجبريلين (GA) الذي يكشفه جهاز qmRGA يعتمد على تركيز الجبريلين وإدراكه، كما هو متوقع بناءً على تصميم المستشعر، قمنا بتحليل تعبير مستقبلات GID1 الثلاثة في الأنسجة الخضرية والتكاثرية. في البادرات، أظهر خط GID1-GUS المُخبِر أن GID1a وGID1c يُعبَّر عنهما بكثرة في الفلقتين (الشكل 3أ-ج). بالإضافة إلى ذلك، تم التعبير عن جميع المستقبلات الثلاثة في الأوراق، وبراعم الجذور الجانبية، وأطراف الجذور (باستثناء غطاء جذر GID1b)، والجهاز الوعائي (الشكل 3أ-ج). في النسيج المرستيمي القمي للزهرة، رصدنا إشارات GUS فقط لـ GID1b وGID1c (الشكل التكميلي 7أ-ج). أكد التهجين الموضعي أنماط التعبير هذه، وأظهر كذلك أن GID1c يُعبَّر عنه بشكل موحد بمستويات منخفضة في النسيج المرستيمي القمي، بينما أظهر GID1b تعبيرًا أعلى في محيط هذا النسيج (الشكل التكميلي 7د-ل). كشف الاندماج الترجمي pGID1b::2xmTQ2-GID1b أيضًا عن نطاق متدرج من تعبير GID1b، من تعبير منخفض أو معدوم في مركز النسيج القمي المرستيمي إلى تعبير عالٍ على حدود العضو (الشكل التكميلي 7م). وبالتالي، فإن مستقبلات GID1 لا تتوزع بشكل متجانس عبر الأنسجة وداخلها. في تجارب لاحقة، لاحظنا أيضًا أن الإفراط في التعبير عن GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) زاد من حساسية qmRGA في السويقة الجنينية لتطبيق GA الخارجي (الشكل 3د، هـ). في المقابل، كان التألق المقاس بواسطة qd17mRGA في السويقة الجنينية غير حساس للمعالجة بـ GA3 (الشكل 3و، ز). في كلا الاختبارين، عولجت الشتلات بتركيزات عالية من GA (100 ميكرومول GA3) لتقييم السلوك السريع للمستشعر، حيث تعززت أو فُقدت قدرته على الارتباط بمستقبل GID1. تؤكد هذه النتائج مجتمعة أن المستشعر الحيوي qmRGA يؤدي وظيفة مشتركة كمستشعر GA و GA، وتشير إلى أن التعبير التفاضلي لمستقبل GID1 يمكن أن يعدل بشكل كبير انبعاثية المستشعر.
حتى الآن، لا يزال توزيع إشارات الجبريلين في النسيج المرستيمي القمي غير واضح. لذلك، استخدمنا نباتات مُعبرة عن جين qmRGA وناقل الخلايا الجذعية pCLV3::mCherry-NLS لحساب خرائط كمية عالية الدقة لنشاط إشارات الجبريلين، مع التركيز على الطبقة L1 (البشرة؛ الشكل 4أ، ب، انظر قسم الطرق والطرق التكميلية)، نظرًا لأن الطبقة L1 تلعب دورًا رئيسيًا في التحكم في نمو النسيج المرستيمي القمي. هنا، وفر التعبير عن pCLV3::mCherry-NLS نقطة مرجعية هندسية ثابتة لتحليل التوزيع المكاني والزماني لنشاط إشارات الجبريلين. على الرغم من أن الجبريلين يُعتبر ضروريًا لتطور الأعضاء الجانبية، فقد لاحظنا انخفاض إشارات الجبريلين في البرعم الزهري (P) بدءًا من المرحلة P3 (الشكل 4أ، ب)، بينما أظهرت البراعم الزهرية الصغيرة P1 وP2 نشاطًا متوسطًا مشابهًا لما هو موجود في المنطقة المركزية (الشكل 4أ، ب). لوحظ ارتفاع في نشاط إشارات حمض الجبريليك (GA) عند حدود براعم الأعضاء، بدءًا من P1/P2 (على جانبي الحد الفاصل) ووصولًا إلى ذروته عند P4، وكذلك في جميع خلايا المنطقة المحيطية الواقعة بين البراعم (الشكل 4أ، ب والشكل التكميلي 8أ، ب). ولوحظ هذا النشاط المرتفع لإشارات حمض الجبريليك ليس فقط في البشرة، بل أيضًا في الطبقتين L2 وL3 العلوية (الشكل التكميلي 8ب). كما بقي نمط إشارات حمض الجبريليك المكتشفة في النسيج المرستيمي القمي (SAM) باستخدام qmRGA دون تغيير بمرور الوقت (الشكل التكميلي 8ج-و، ك). وعلى الرغم من انخفاض تنظيم بنية qd17mRGA بشكل منهجي في النسيج المرستيمي القمي لنباتات الجيل الثالث (T3) من خمسة سلالات مستقلة قمنا بتوصيفها بالتفصيل، فقد تمكنا من تحليل أنماط التألق التي تم الحصول عليها باستخدام بنية pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (الشكل التكميلي 8ز-ي، ل). في خط التحكم هذا، لم تُلاحظ سوى تغيرات طفيفة في نسبة التألق في النسيج القمي المرستيمي، ولكن في مركز هذا النسيج، لاحظنا انخفاضًا واضحًا وغير متوقع في بروتين VENUS المرتبط ببروتين TagBFP. يؤكد هذا أن نمط الإشارات الذي رصده تحليل qmRGA يعكس التحلل المعتمد على حمض الجبريليك (GA) لبروتين mRGA-VENUS، ولكنه يُظهر أيضًا أن تحليل qmRGA قد يُبالغ في تقدير نشاط إشارات حمض الجبريليك في مركز النسيج القمي. باختصار، تكشف نتائجنا عن نمط إشارات حمض الجبريليك الذي يعكس في المقام الأول توزيع البراعم الأولية. ويعود هذا التوزيع للمنطقة بين البراعم الأولية (IPR) إلى التأسيس التدريجي لنشاط إشارات حمض الجبريليك العالي بين البرعم الأولي النامي والمنطقة المركزية، بينما يتناقص نشاط إشارات حمض الجبريليك في البرعم الأولي نفسه (الشكل 4ج، د).
يشير توزيع مستقبلات GID1b وGID1c (انظر أعلاه) إلى أن التعبير التفاضلي لمستقبلات حمض الجبريليك (GA) يُسهم في تشكيل نمط نشاط إشارات حمض الجبريليك في النسيج القمي للساق (SAM). وتساءلنا عما إذا كان التراكم التفاضلي لحمض الجبريليك قد يكون له دور في ذلك. وللتحقق من هذا الاحتمال، استخدمنا مستشعر nlsGPS1 GA FRET²¹. وقد رُصد ازدياد في معدل التنشيط في النسيج القمي للساق لـ nlsGPS1 المعالج بـ 10 ميكرومتر من GA4+7 لمدة 100 دقيقة (الشكل التكميلي 9أ-هـ)، مما يدل على أن nlsGPS1 يستجيب للتغيرات في تركيز حمض الجبريليك في النسيج القمي للساق، كما هو الحال في الجذور²¹. وكشف التوزيع المكاني لمعدل تنشيط nlsGPS1 عن مستويات منخفضة نسبيًا من حمض الجبريليك في الطبقات الخارجية للنسيج القمي للساق، ولكنه أظهر ارتفاعها في المركز وعلى حدود النسيج القمي للساق (الشكل 4هـ والشكل التكميلي 9أ، ج). يشير هذا إلى أن حمض الغلوتاميك (GA) يتوزع أيضًا في الطبقة القمية القمية (SAM) بنمط مكاني مماثل لما كشف عنه تحليل qmRGA. وكأسلوب تكميلي، قمنا أيضًا بمعالجة الطبقة القمية القمية بحمض الغلوتاميك الفلوري (GA3-، GA4-، GA7-Fl) أو الفلوري وحده كعنصر تحكم سلبي. توزعت إشارة الفلوري في جميع أنحاء الطبقة القمية القمية، بما في ذلك المنطقة المركزية والبرعم الأولي، وإن كان ذلك بكثافة أقل (الشكل 4j والشكل التكميلي 10d). في المقابل، تراكمت جميع أنواع GA-Fl الثلاثة تحديدًا داخل حدود البرعم الأولي وبدرجات متفاوتة في بقية منطقة ما بين القمتين (IPR)، حيث تراكم GA7-Fl في أكبر منطقة في منطقة ما بين القمتين (الشكل 4k والشكل التكميلي 10a، b). أظهر قياس شدة الفلورة أن نسبة شدة الفلورة في منطقة ما بين القمتين إلى شدتها في المناطق الأخرى كانت أعلى في الطبقة القمية القمية المعالجة بـ GA-Fl مقارنةً بالطبقة القمية القمية المعالجة بالفلوري فقط (الشكل 4l والشكل التكميلي 10c). تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى أن حمض الجبريليك (GA) يتواجد بتركيزات أعلى في خلايا IPR الأقرب إلى حدود العضو. وهذا يُوحي بأن نمط نشاط إشارات حمض الجبريليك في النسيج المرستيمي القمي (SAM) ناتج عن كلٍّ من التعبير التفاضلي لمستقبلات حمض الجبريليك وتراكمه التفاضلي في خلايا IPR القريبة من حدود العضو. وبذلك، كشف تحليلنا عن نمط مكاني-زماني غير متوقع لإشارات حمض الجبريليك، حيث كان النشاط أقل في مركز وبداية النسيج المرستيمي القمي، وأعلى في خلايا IPR في المنطقة المحيطية.
لفهم دور نشاط إشارات الجبريلين التفاضلي في النسيج المرستيمي القمي للساق، قمنا بتحليل العلاقة بين نشاط إشارات الجبريلين، وتمدد الخلايا، وانقسامها باستخدام التصوير الزمني المتسلسل في الوقت الحقيقي للنسيج المرستيمي القمي للساق qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. ونظرًا لدور الجبريلين في تنظيم النمو، كان من المتوقع وجود ارتباط إيجابي مع معايير تمدد الخلايا. لذلك، قارنا أولًا خرائط نشاط إشارات الجبريلين مع خرائط معدل نمو سطح الخلية (كمؤشر لقوة تمدد الخلية لخلية معينة وللخلايا الوليدة عند الانقسام) ومع خرائط تباين النمو، الذي يقيس اتجاه تمدد الخلية (المستخدم هنا أيضًا لخلية معينة وللخلايا الوليدة عند الانقسام؛ الشكل 5أ، ب، انظر قسم الطرق والطرق التكميلية). تتوافق خرائطنا لمعدل نمو سطح خلايا النسيج المرستيمي القمي للساق مع الملاحظات السابقة^38،39، حيث تكون معدلات النمو في حدها الأدنى عند الحدود، وفي حدها الأقصى في الأزهار النامية (الشكل 5أ). أظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وجود ارتباط عكسي بين نشاط إشارات حمض الجبريليك (GA) وشدة نمو سطح الخلية (الشكل 5ج). كما أظهرنا أن المحاور الرئيسية للتغير، بما في ذلك مدخلات إشارات حمض الجبريليك وشدة النمو، كانت متعامدة مع الاتجاه المحدد بواسطة التعبير العالي عن CLV3، مما يؤكد استبعاد الخلايا من مركز النسيج المرستيمي القمي (SAM) في التحليلات المتبقية. أكد تحليل ارتباط سبيرمان نتائج تحليل المكونات الرئيسية (الشكل 5د)، مشيرًا إلى أن ارتفاع إشارات حمض الجبريليك في منطقة ما بين الظهارة (IPR) لم يؤدِ إلى زيادة تمدد الخلايا. مع ذلك، كشف تحليل الارتباط عن وجود ارتباط إيجابي طفيف بين نشاط إشارات حمض الجبريليك وتغاير النمو (الشكل 5ج، د)، مما يوحي بأن ارتفاع إشارات حمض الجبريليك في منطقة ما بين الظهارة يؤثر على اتجاه نمو الخلايا، وربما على موضع مستوى انقسام الخلية.
أ، ب: خرائط حرارية لمتوسط ​​نمو السطح (أ) وتباين النمو (ب) في النسيج المرستيمي القمي للساق (SAM)، محسوبة على سبع نباتات مستقلة (استُخدمت كمؤشرات لقوة واتجاه تمدد الخلايا، على التوالي). ج: شمل تحليل المكونات الرئيسية (PCA) المتغيرات التالية: إشارة حمض الجبريليك (GA)، وشدة نمو السطح، وتباين نمو السطح، وتعبير جين CLV3. ارتبط المكون الأول من تحليل المكونات الرئيسية (PCA) بشكل سلبي مع شدة نمو السطح، وارتبط بشكل إيجابي مع إشارة حمض الجبريليك (GA). وارتبط المكون الثاني من تحليل المكونات الرئيسية (PCA) بشكل إيجابي مع تباين نمو السطح، وارتبط بشكل سلبي مع تعبير جين CLV3. تمثل النسب المئوية التباين الذي يفسره كل مكون. د: تحليل ارتباط سبيرمان بين إشارة حمض الجبريليك (GA)، وشدة نمو السطح، وتباين نمو السطح على مستوى النسيج باستثناء منطقة التكاثر (CZ). الرقم الموجود على اليمين هو قيمة معامل ارتباط سبيرمان (rho) بين متغيرين. تشير النجوم إلى الحالات التي يكون فيها الارتباط/الارتباط السلبي ذا دلالة إحصائية عالية. هـ: تصوير ثلاثي الأبعاد لخلايا Col-0 SAM L1 باستخدام المجهر متحد البؤر. تُلوَّن الجدران الخلوية الجديدة المتكونة في النسيج القمي المرستيمي (وليس في البرعم الأولي) بعد 10 ساعات وفقًا لقيم زواياها. يظهر شريط الألوان في الزاوية السفلية اليمنى. تُظهر الصورة المُدرجة الصورة ثلاثية الأبعاد المقابلة عند 0 ساعة. أُعيدت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. تُظهر المخططات الصندوقية معدلات انقسام الخلايا في النسيج القمي المرستيمي لنبات Col-0 المُعالج بتقنية IPR وغير المُعالج بها (عدد النباتات المستقلة = 10). يُشير الخط المركزي إلى الوسيط، وتُشير حدود الصندوق إلى المئين 25 والمئين 75. تُشير الخطوط إلى القيم الدنيا والقصوى المُحددة باستخدام برنامج R. تم الحصول على قيم P باستخدام اختبار t ثنائي الطرف لـ Welch. g، h رسم تخطيطي يوضح (g) كيفية قياس زاوية جدار الخلية الجديد (باللون الأرجواني) بالنسبة للاتجاه القطري من مركز النسيج الإنشائي القمي (الخط الأبيض المنقط) (تُؤخذ في الاعتبار فقط قيم الزوايا الحادة، أي من 0 إلى 90 درجة)، و(h) الاتجاهات المحيطية/الجانبية والقطرية داخل النسيج الإنشائي. i رسوم بيانية لتوزيع ترددات اتجاه مستوى انقسام الخلية عبر النسيج الإنشائي القمي (أزرق داكن)، والنسيج الإنشائي القمي الداخلي (أزرق متوسط)، والنسيج غير الإنشائي القمي الداخلي (أزرق فاتح)، على التوالي. تم الحصول على قيم P باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف ثنائي الطرف. أُعيدت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. j رسوم بيانية لتوزيع ترددات اتجاه مستوى انقسام الخلية للنسيج الإنشائي القمي الداخلي حول P3 (أخضر فاتح)، وP4 (أخضر متوسط)، وP5 (أخضر داكن)، على التوالي. تم الحصول على قيم P باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف ثنائي الطرف. أُعيدت التجربة مرتين بنتائج مماثلة.
لذا، قمنا بعد ذلك بدراسة العلاقة بين إشارات حمض الجبريليك ونشاط انقسام الخلايا من خلال تحديد جدران الخلايا المتكونة حديثًا أثناء الاختبار (الشكل 5هـ). وقد مكّننا هذا النهج من قياس تردد واتجاه انقسام الخلايا. والمثير للدهشة أننا وجدنا أن تردد انقسام الخلايا في منطقة ما بين الظهارة الوعائية (IPR) وبقية النسيج المرستيمي القمي (SAM) (غير IPR، الشكل 5و) كان متقاربًا، مما يشير إلى أن الاختلافات في إشارات حمض الجبريليك بين خلايا IPR وغير IPR لا تؤثر بشكل كبير على انقسام الخلايا. هذا، بالإضافة إلى الارتباط الإيجابي بين إشارات حمض الجبريليك وتباين النمو، دفعنا إلى التساؤل عما إذا كان نشاط إشارات حمض الجبريليك يؤثر على اتجاه مستوى انقسام الخلايا. قمنا بقياس اتجاه جدار الخلية الجديد كزاوية حادة بالنسبة للمحور القطري الواصل بين مركز النسيج الإنشائي ومركز جدار الخلية الجديد (الشكل 5هـ-ط)، ولاحظنا ميلًا واضحًا للخلايا للانقسام بزوايا قريبة من 90° بالنسبة للمحور القطري، مع أعلى ترددات مُسجلة عند 70-80° (23.28%) و80-90° (22.62%) (الشكل 5هـ، ط)، وهو ما يتوافق مع انقسامات الخلايا في الاتجاه المحيطي/العرضي (الشكل 5ح). ولدراسة مساهمة إشارات حمض الجبريليك في سلوك انقسام الخلايا هذا، قمنا بتحليل معايير انقسام الخلايا في منطقة IPR وخارجها بشكل منفصل (الشكل 5ط). لاحظنا أن توزيع زاوية الانقسام في خلايا IPR يختلف عن توزيعها في الخلايا غير IPR أو في خلايا النسيج القمي المرستيمي بأكمله، حيث أظهرت خلايا IPR نسبة أعلى من الانقسامات الخلوية الجانبية/الدائرية، أي 70-80 درجة و80-90 درجة (33.86% و30.71% على التوالي، النسب المقابلة) (الشكل 5i). وبذلك، كشفت ملاحظاتنا عن وجود ارتباط بين ارتفاع إشارات حمض الجبريليك (GA) واتجاه مستوى انقسام الخلية القريب من الاتجاه المحيطي، على غرار الارتباط بين نشاط إشارات حمض الجبريليك (GA) وتغاير النمو (الشكل 5c، d). ولتأكيد الحفاظ المكاني على هذا الارتباط، قمنا بقياس اتجاه مستوى الانقسام في خلايا IPR المحيطة بالبرعم الأولي بدءًا من اليوم الثالث بعد الولادة (P3)، حيث تم رصد أعلى نشاط لإشارات حمض الجبريليك (GA) في هذه المنطقة بدءًا من اليوم الرابع بعد الولادة (P4) (الشكل 4). لم تُظهر زوايا انقسام الخلايا في منطقة ما بين الظهارة الوعائية (IPR) حول اليومين الثالث والرابع بعد الولادة (P3 وP4) فروقًا ذات دلالة إحصائية، على الرغم من ملاحظة زيادة في وتيرة الانقسامات الخلوية الجانبية في منطقة ما بين الظهارة الوعائية حول اليوم الرابع بعد الولادة (P4) (الشكل 5j). مع ذلك، في خلايا منطقة ما بين الظهارة الوعائية حول اليوم الخامس بعد الولادة (P5)، أصبح الاختلاف في اتجاه مستوى انقسام الخلية ذا دلالة إحصائية، مع زيادة حادة في وتيرة الانقسامات الخلوية المستعرضة (الشكل 5j). تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى أن إشارات حمض الجبريليك (GA) قادرة على التحكم في اتجاه انقسامات الخلايا في النسيج القمي الوعائي (SAM)، وهو ما يتوافق مع التقارير السابقة^40،41 التي تفيد بأن ارتفاع إشارات حمض الجبريليك (GA) يمكن أن يحفز التوجه الجانبي لانقسامات الخلايا في منطقة ما بين الظهارة الوعائية (IPR).
من المتوقع ألا تندمج الخلايا في منطقة ما بين العقد (IPR) في البراعم الأولية، بل في العقد الداخلية (2، 42، 43). قد يؤدي التوجه العرضي لانقسامات الخلايا في منطقة ما بين العقد إلى التنظيم النموذجي لصفوف طولية متوازية من خلايا البشرة في العقد الداخلية. تشير ملاحظاتنا المذكورة أعلاه إلى أن إشارات حمض الجبريليك (GA) تلعب على الأرجح دورًا في هذه العملية من خلال تنظيم اتجاه انقسام الخلايا.
يؤدي فقدان وظيفة العديد من جينات DELLA إلى استجابة مستمرة لهرمون الجبريلين، ويمكن استخدام طفرات della لاختبار هذه الفرضية⁴⁴. قمنا أولاً بتحليل أنماط التعبير لخمسة جينات DELLA في النسيج المرستيمي القمي للساق. كشف الاندماج النسخي لسلالة GUS⁴⁵ أن GAI وRGA وRGL1 وRGL2 (بدرجة أقل بكثير) يتم التعبير عنها في النسيج المرستيمي القمي للساق (الشكل التكميلي 11أ-د). أظهر التهجين الموضعي كذلك أن mRNA الخاص بـ GAI يتراكم تحديدًا في البراعم الأولية والأزهار النامية (الشكل التكميلي 11هـ). تم الكشف عن mRNA الخاص بـ RGL1 وRGL3 في جميع أنحاء مظلة النسيج المرستيمي القمي للساق وفي الأزهار الأكبر سنًا، بينما كان mRNA الخاص بـ RGL2 أكثر وفرة في المنطقة الحدودية (الشكل التكميلي 11و-ح). أكد التصوير المجهري متحد البؤر لـ pRGL3::RGL3-GFP SAM التعبيرَ المُلاحَظَ بواسطة التهجين الموضعي، وأظهر تراكم بروتين RGL3 في الجزء المركزي من SAM (الشكل التكميلي 11i). وباستخدام سلالة pRGA::GFP-RGA، وجدنا أيضًا تراكم بروتين RGA في SAM، لكن وفرته تتناقص عند الحدود بدءًا من اليوم الرابع بعد الولادة (P4) (الشكل التكميلي 11j). والجدير بالذكر أن أنماط التعبير عن RGL3 وRGA تتوافق مع ارتفاع نشاط إشارات GA في منطقة ما بين الظهارة والظهارة، كما تم الكشف عنه بواسطة qmRGA (الشكل 4). علاوة على ذلك، تشير هذه البيانات إلى أن جميع بروتينات DELLA تُعبَّر عنها في SAM، وأن تعبيرها يشمل SAM بأكمله.
بعد ذلك، قمنا بتحليل معايير انقسام الخلايا في النمط البري من الخلايا الجذعية القمية (Ler، كعنصر تحكم) والطفرات الخماسية (العالمية) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (الشكل 6أ، ب). ومن المثير للاهتمام، أننا لاحظنا تحولًا ذا دلالة إحصائية في توزيع ترددات زوايا انقسام الخلايا في الخلايا الجذعية القمية للطفرة العالمية della مقارنةً بالنمط البري (الشكل 6ج). ويعود هذا التغير في الطفرة العالمية della إلى زيادة في تردد الزوايا 80-90 درجة (34.71% مقابل 24.55%)، وبدرجة أقل، الزوايا 70-80 درجة (23.78% مقابل 20.18%)، أي ما يتوافق مع الانقسامات الخلوية العرضية (الشكل 6ج). كان معدل الانقسامات غير المستعرضة (0-60 درجة) أقل أيضًا في الطفرة العالمية della (الشكل 6ج). وازداد معدل الانقسامات الخلوية المستعرضة بشكل ملحوظ في النسيج القمي القمي (SAM) للطفرة العالمية della (الشكل 6ب). كما كان معدل الانقسامات الخلوية المستعرضة في منطقة ما بين الضلعين (IPR) أعلى في الطفرة العالمية della مقارنةً بالنمط البري (الشكل 6د). خارج منطقة ما بين الضلعين، أظهر النمط البري توزيعًا أكثر تجانسًا لزوايا الانقسام الخلوي، بينما فضّلت الطفرة العالمية della الانقسامات المماسية كما في منطقة ما بين الضلعين (الشكل 6هـ). وقمنا أيضًا بقياس اتجاه الانقسامات الخلوية في النسيج القمي القمي (SAM) للطفرات الخماسية لأكسيداز ga2 (ga2ox) (ga2ox1-1، ga2ox2-1، ga2ox3-1، ga2ox4-1، وga2ox6-2)، وهي خلفية طفرية غير نشطة لـ GA حيث يتراكم GA. تماشيًا مع ارتفاع مستويات حمض الجبريلين، كان النسيج القمي المرستيمي (SAM) في نورة الطفرة الخماسية ga2ox أكبر من نظيره في Col-0 (الشكل التكميلي 12أ، ب). وبالمقارنة مع Col-0، أظهر النسيج القمي المرستيمي في الطفرة الخماسية ga2ox توزيعًا مختلفًا بشكل واضح لزوايا انقسام الخلايا، حيث ازداد تردد الزاوية من 50° إلى 90°، مما يُرجّح الانقسامات المماسية (الشكل التكميلي 12أ-ج). وبذلك، نُبين أن التنشيط المستمر لإشارات حمض الجبريلين وتراكمه يحفزان انقسامات الخلايا الجانبية في منطقة ما بين الجذور (IPR) وبقية النسيج القمي المرستيمي.
أ، ب: تصوير ثلاثي الأبعاد للطبقة L1 من النسيج القمي المرستيمي (SAM) لنبات Ler المصبوغ بـ PI (أ) ونبات الطفرة della الشاملة (ب) باستخدام المجهر متحد البؤر. تظهر جدران الخلايا الجديدة المتكونة في النسيج القمي المرستيمي (وليس في البرعم الأولي) على مدار 10 ساعات، وتُلوّن وفقًا لقيم زواياها. يُظهر الشكل المُدرج النسيج القمي المرستيمي عند 0 ساعة. يظهر شريط الألوان في الزاوية السفلية اليمنى. يشير السهم في (ب) إلى مثال على صفوف الخلايا المتراصفة في الطفرة della الشاملة. أُعيدت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. ج: مقارنة لتوزيع تردد اتجاهات مستوى انقسام الخلايا في النسيج القمي المرستيمي بأكمله (د)، ومنطقة ما بين الطورين (هـ)، وغير منطقة ما بين الطورين (و) بين Ler و della الشاملة. تم الحصول على قيم P باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف ثنائي الطرف. f، g: تصوير ثلاثي الأبعاد لصور مجهرية بؤرية لطبقة المرستيم القمي (SAM) المصبوغة بصبغة PI لنباتات Col-0 (i) وpCUC2::gai-1-VENUS المعدلة وراثيًا (j). تُظهر اللوحتان (a، b) جدرانًا خلوية جديدة (وليس براعم) تشكلت في طبقة المرستيم القمي خلال 10 ساعات. أُعيدت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. h–j: مقارنة لتوزيع تردد اتجاهات مستوى انقسام الخلايا في طبقة المرستيم القمي بأكملها (h)، ومنطقة ما بين البراعم (IPR) (i)، والمنطقة غير الواقعة ضمن منطقة ما بين البراعم (j) بين نباتات Col-0 وpCUC2::gai-1-VENUS. تم الحصول على قيم P باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف ثنائي الطرف.
بعد ذلك، اختبرنا تأثير تثبيط إشارات حمض الجبريليك (GA) تحديدًا في منطقة ما بين الفلقتين (IPR). ولتحقيق هذه الغاية، استخدمنا مُحفِّز جين كأس الفلقة 2 (CUC2) لتوجيه التعبير عن بروتين gai-1 السائد السلبي المدمج مع VENUS (في سلالة pCUC2::gai-1-VENUS). في النسيج المرستيمي القمي (SAM) للنمط البري، يُحفِّز مُحفِّز CUC2 التعبير عن معظم مناطق ما بين الفلقتين في النسيج المرستيمي القمي، بما في ذلك الخلايا الحدودية، بدءًا من اليوم الرابع بعد الولادة (P4)، ولوحظ تعبير نوعي مماثل في نباتات pCUC2::gai-1-VENUS (انظر أدناه). لم يكن توزيع زوايا انقسام الخلايا عبر النسيج المرستيمي القمي أو منطقة ما بين الفلقتين في نباتات pCUC2::gai-1-VENUS مختلفًا بشكل ملحوظ عن النمط البري، على الرغم من أننا وجدنا بشكل غير متوقع أن الخلايا التي لا تحتوي على منطقة ما بين الفلقتين في هذه النباتات تنقسم بتردد أعلى يتراوح بين 80 و90 درجة (الشكل 6f-j).
لقد أشير إلى أن اتجاه انقسام الخلايا يعتمد على هندسة النسيج القمي المرستيمي (SAM)، ولا سيما الإجهاد الشدّي الناتج عن انحناء النسيج⁴⁶. لذلك، تساءلنا عما إذا كان شكل النسيج القمي المرستيمي قد تغير في الطفرة العالمية della ونباتات pCUC2::gai-1-VENUS. وكما ذُكر سابقًا¹²، كان حجم النسيج القمي المرستيمي في الطفرة العالمية della أكبر من حجمه في النوع البري (الشكل التكميلي 13أ، ب، د). أكد التهجين الموضعي لـ CLV3 وSTM RNA تمدد النسيج القمي في طفرات della، وأظهر كذلك التوسع الجانبي لمكانة الخلية الجذعية (الشكل التكميلي 13هـ، و، ح، ط). مع ذلك، كان انحناء النسيج القمي المرستيمي متشابهًا في كلا النمطين الوراثيين (الشكل التكميلي 13ك، م، ن، ع). لاحظنا زيادة مماثلة في الحجم في الطفرة الرباعية della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 دون تغيير في الانحناء مقارنةً بالنمط البري (الشكل التكميلي 13 ج، د، ز، ي، ل، س، ع). كما تأثر تردد اتجاه انقسام الخلايا في الطفرة الرباعية della، ولكن بدرجة أقل من الطفرة المتجانسة della (الشكل التكميلي 12 د-و). يشير هذا التأثير الجرعي، إلى جانب عدم وجود تأثير على الانحناء، إلى أن النشاط المتبقي لـ RGL3 في الطفرة الرباعية della يحد من التغيرات في اتجاه انقسام الخلايا الناتجة عن فقدان نشاط DELLA، وأن التغيرات في الانقسامات الخلوية الجانبية تحدث استجابةً للتغيرات في نشاط إشارات GA وليس للتغيرات في هندسة SAM. كما ذُكر سابقًا، يُحفز مُحفز CUC2 التعبير عن IPR في النسيج القمي القمّي (SAM) بدءًا من اليوم الرابع بعد الولادة (الشكل التكميلي 14أ، ب). وعلى النقيض، كان حجم النسيج القمي القمّي المُعدّل وراثيًا pCUC2::gai-1-VENUS أصغر، لكن انحناؤه كان أعلى (الشكل التكميلي 14ج-ح). قد يُؤدي هذا التغيير في مورفولوجيا النسيج القمي القمّي المُعدّل وراثيًا pCUC2::gai-1-VENUS إلى توزيع مختلف للإجهادات الميكانيكية مقارنةً بالنمط البري، حيث تبدأ الإجهادات المحيطية العالية على مسافة أقصر من مركز النسيج القمي القمّي⁴⁷. وبدلاً من ذلك، قد تنتج التغييرات في مورفولوجيا النسيج القمي القمّي المُعدّل وراثيًا pCUC2::gai-1-VENUS عن تغييرات في الخصائص الميكانيكية الإقليمية الناتجة عن التعبير الجيني⁴⁸. في كلتا الحالتين، قد يُعوض هذا جزئيًا آثار التغييرات في إشارات GA عن طريق زيادة احتمالية انقسام الخلايا في الاتجاه المحيطي/العرضي، مما يُفسر ملاحظاتنا.
تؤكد بياناتنا مجتمعةً أن إشارات حمض الجبريليك (GA) تلعب دورًا فعالًا في التوجيه الجانبي لمستوى انقسام الخلايا في منطقة ما بين الظهارة والظهارة (IPR). كما تُظهر أن انحناء النسيج الإنشائي يؤثر أيضًا على توجيه مستوى انقسام الخلايا في منطقة ما بين الظهارة والظهارة.
يشير التوجه العرضي لمستوى الانقسام في منطقة ما بين العقد (IPR)، نتيجةً لنشاط إشارات الجبريلين العالي، إلى أن الجبريلين يُهيئ مسبقًا صفًا خلويًا شعاعيًا في البشرة ضمن النسيج المرستيمي القمي (SAM) لتحديد التنظيم الخلوي الذي سيُلاحظ لاحقًا في السلامية البشرية. في الواقع، كانت هذه الصفوف الخلوية مرئية بشكل متكرر في صور النسيج المرستيمي القمي لطفرات della العالمية (الشكل 6ب). لذا، ولمزيد من استكشاف الوظيفة التطورية للنمط المكاني لإشارات الجبريلين في النسيج المرستيمي القمي، استخدمنا التصوير المتعاقب لتحليل التنظيم المكاني للخلايا في منطقة ما بين العقد في النباتات البرية (Ler وCol-0)، وطفرات della العالمية، والنباتات المعدلة وراثيًا pCUC2::gai-1-VENUS.
وجدنا أن تقنية qmRGA أظهرت أن نشاط إشارات حمض الجبريليك (GA) في منطقة ما قبل البلاستيدات (IPR) يزداد من اليوم الأول/الثاني بعد الولادة (P1/P2) ويبلغ ذروته في اليوم الرابع بعد الولادة (P4)، وظل هذا النمط ثابتًا بمرور الوقت (الشكل 4أ-و، والشكل التكميلي 8ج-و، ك). ولتحليل التنظيم المكاني للخلايا في منطقة ما قبل البلاستيدات مع ازدياد إشارة حمض الجبريليك، قمنا بتصنيف خلايا منطقة ما قبل البلاستيدات (Ler IPR) فوق وجوانب اليوم الرابع بعد الولادة (P4) وفقًا لمصيرها النمائي الذي تم تحليله بعد 34 ساعة من الملاحظة الأولى، أي بعد أكثر من ضعف زمن البلاستيدات، مما سمح لنا بتتبع خلايا منطقة ما قبل البلاستيدات (IPR) أثناء نمو البلاستيدات من اليوم الأول/الثاني بعد الولادة (P1/P2) إلى اليوم الرابع بعد الولادة (P4). استخدمنا ثلاثة ألوان مختلفة: الأصفر للخلايا التي اندمجت في البلاستيدات بالقرب من اليوم الرابع بعد الولادة (P4)، والأخضر للخلايا الموجودة في منطقة ما قبل البلاستيدات (IPR)، والبنفسجي للخلايا التي شاركت في كلتا العمليتين (الشكل 7أ-ج). عند الزمن t0 (0 ساعة)، كانت طبقة أو طبقتان من خلايا منطقة ما قبل البلاستيدات (IPR) مرئية أمام اليوم الرابع بعد الولادة (P4) (الشكل 7أ). كما هو متوقع، انقسمت هذه الخلايا عند انقسامها بشكل رئيسي عبر مستوى الانقسام العرضي (الشكل 7أ-ج). وقد تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام نسيج الساق المرستيمي Col-0 (مع التركيز على P3، الذي ينطوي طرفه بشكل مشابه لـ P4 في Ler)، على الرغم من أن الطية المتكونة عند حافة الزهرة في هذا النمط الوراثي أخفت خلايا IPR بسرعة أكبر (الشكل 7ز-ط). وبالتالي، فإن نمط انقسام خلايا IPR يُهيئ الخلايا مسبقًا في صفوف شعاعية، كما هو الحال في السلاميات. ويشير تنظيم الصفوف الشعاعية وتمركز خلايا IPR بين الأعضاء المتتالية إلى أن هذه الخلايا هي خلايا سلفية للعقد.
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير مستشعر حيوي نسبي لإشارات حمض الجبريليك (GA)، أطلقنا عليه اسم qmRGA، والذي يسمح برسم خرائط كمية لنشاط إشارات حمض الجبريليك الناتج عن تركيزات حمض الجبريليك ومستقبلاته مجتمعة، مع تقليل التداخل مع مسارات الإشارات الداخلية، مما يوفر معلومات حول وظيفة حمض الجبريليك على المستوى الخلوي. ولتحقيق هذه الغاية، قمنا بتصميم بروتين DELLA معدل، أطلقنا عليه اسم mRGA، فقد قدرته على الارتباط بشركاء تفاعل DELLA ولكنه يظل حساسًا للتحلل البروتيني الناتج عن حمض الجبريليك. يستجيب qmRGA للتغيرات الخارجية والداخلية في مستويات حمض الجبريليك، وتتيح خصائصه الاستشعارية الديناميكية تقييم التغيرات المكانية والزمانية في نشاط إشارات حمض الجبريليك أثناء النمو. كما يُعد qmRGA أداة مرنة للغاية، حيث يمكن تكييفه مع أنسجة مختلفة عن طريق تغيير المحفز المستخدم للتعبير عنه (إذا لزم الأمر)، ونظرًا لطبيعة مسار إشارات حمض الجبريليك المحفوظة ونمط PFYRE عبر كاسيات البذور، فمن المرجح أن يكون قابلاً للتطبيق على أنواع أخرى. تماشيًا مع ذلك، أظهرت طفرة مماثلة في بروتين SLR1 DELLA في الأرز (HYY497AAA) أنها تثبط نشاط SLR1 كمثبط للنمو، مع تقليل طفيف فقط لتحلله بوساطة حمض الجبريليك، على غرار mRGA23. ومن الجدير بالذكر أن دراسات حديثة في نبات الرشاد أظهرت أن طفرة حمض أميني واحد في نطاق PFYRE (S474L) تُغير النشاط النسخي لـ RGA دون التأثير على قدرته على التفاعل مع عوامل النسخ الشريكة⁵⁰. وعلى الرغم من أن هذه الطفرة قريبة جدًا من استبدالات الأحماض الأمينية الثلاثة الموجودة في mRGA، فإن دراساتنا تُظهر أن هاتين الطفرتين تُغيران خصائص مميزة لـ DELLA. فعلى الرغم من أن معظم عوامل النسخ الشريكة ترتبط بنطاقي LHR1 وSAW في DELLA^26،51، إلا أن بعض الأحماض الأمينية المحفوظة في نطاق PFYRE قد تُساعد في استقرار هذه التفاعلات.
يُعدّ نمو السلاميات سمةً أساسيةً في بنية النبات وتحسين إنتاجيته. كشف تحليل qmRGA عن نشاطٍ أعلى لإشارات حمض الجبريليك (GA) في الخلايا السلفية للسلاميات في منطقة ما بين العقد (IPR). ومن خلال الجمع بين التصوير الكمي وعلم الوراثة، أظهرنا أن أنماط إشارات حمض الجبريليك تُركّب مستويات انقسام خلوي دائرية/مستعرضة في بشرة النسيج المرستيمي القمي (SAM)، مما يُشكّل تنظيم انقسام الخلايا اللازم لنمو السلاميات. وقد تم تحديد العديد من مُنظِّمات اتجاه مستوى انقسام الخلايا أثناء النمو^52،53. يُقدّم عملنا مثالًا واضحًا على كيفية تنظيم نشاط إشارات حمض الجبريليك لهذا المُعامل الخلوي. يُمكن لبروتين DELLA التفاعل مع مُركّبات البروتين قبل الطي⁴¹، لذا قد تُنظّم إشارات حمض الجبريليك اتجاه مستوى انقسام الخلايا من خلال التأثير المُباشر على اتجاه الأنابيب الدقيقة القشرية^{40،41،54،55}. وقد أظهرنا بشكلٍ غير مُتوقّع أنه في النسيج المرستيمي القمي، لم يكن مُرتبط نشاط إشارات حمض الجبريليك الأعلى هو استطالة الخلايا أو انقسامها، بل فقط تباين النمو، وهو ما يتوافق مع تأثير مُباشر لحمض الجبريليك على اتجاه انقسام الخلايا في منطقة ما بين العقد. مع ذلك، لا يمكننا استبعاد أن يكون هذا التأثير غير مباشر، كأن يكون ناتجًا عن تليين جدار الخلية بفعل حمض الجبريليك (GA)⁵⁶. تُحدث التغيرات في خصائص جدار الخلية إجهادًا ميكانيكيًا^57،58، والذي بدوره قد يؤثر على اتجاه مستوى انقسام الخلية من خلال التأثير على اتجاه الأنيبيبات الدقيقة القشرية^39،46،59. قد يكون للتأثيرات المُجتمعة للإجهاد الميكانيكي الناتج عن حمض الجبريليك والتنظيم المباشر لاتجاه الأنيبيبات الدقيقة بواسطة هذا الحمض دورٌ في توليد نمطٍ مُحدد لاتجاه انقسام الخلية في منطقة ما بين العقد (IPR) لتحديد المسافات بين العقد، وتتطلب هذه الفكرة مزيدًا من الدراسات لاختبارها. وبالمثل، أبرزت دراسات سابقة أهمية البروتينات المتفاعلة مع بروتينات DELLA، وهما TCP14 و15، في التحكم بتكوين المسافات بين العقد^60،61، وقد تتوسط هذه العوامل عمل حمض الجبريليك مع بروتيني BREVIPEDICELLUS (BP) وPENNYWISE (PNY)، اللذين ينظمان نمو المسافات بين العقد، وقد ثبت تأثيرهما على إشارات حمض الجبريليك^2،62. بالنظر إلى أن DELLAs تتفاعل مع مسارات إشارات براسينوستيرويد، والإيثيلين، وحمض الجاسمونيك، وحمض الأبسيسيك (ABA) 63،64 وأن هذه الهرمونات يمكن أن تؤثر على اتجاه الأنابيب الدقيقة 65، فإن تأثيرات GA على اتجاه انقسام الخلايا قد تتوسطها أيضًا هرمونات أخرى.
أظهرت دراسات خلوية مبكرة أن كلا المنطقتين الداخلية والخارجية من النسيج القمي المرستيمي لنبات الأرابيدوبسيس ضروريتان لنمو السلاميات^2،42. ويدعم تنظيم حمض الجبريليك (GA) الفعال لانقسام الخلايا في الأنسجة الداخلية¹² وظيفة مزدوجة له ​​في تنظيم حجم النسيج القمي المرستيمي والسلاميات في هذا النسيج. كما أن نمط انقسام الخلايا الموجه يخضع لتنظيم دقيق في النسيج القمي المرستيمي الداخلي، وهذا التنظيم ضروري لنمو الساق⁵². وسيكون من المثير للاهتمام دراسة ما إذا كان لحمض الجبريليك دور في توجيه مستوى انقسام الخلايا في بنية النسيج القمي المرستيمي الداخلي، وبالتالي مزامنة تحديد وتطور السلاميات داخل هذا النسيج.
تمت زراعة النباتات في المختبر في التربة أو وسط موراشيغ-سكوج (MS) بتركيز 1x (دوشيفا) مضافًا إليه 1% سكروز و1% أجار (سيجما) في ظل ظروف قياسية (16 ساعة إضاءة، 22 درجة مئوية)، باستثناء تجارب نمو السويقة الجنينية والجذور حيث تمت زراعة الشتلات على أطباق عمودية تحت إضاءة ثابتة ودرجة حرارة 22 درجة مئوية. أما بالنسبة لتجارب النترات، فقد تمت زراعة النباتات على وسط موراشيغ-سكوج معدل (وسط بيوورلد النباتي) مضافًا إليه كمية كافية من النترات (0 أو 10 ملي مولار من نترات البوتاسيوم)، و0.5 ملي مولار من سكسينات الأمونيوم، و1% سكروز، و1% أجار (سيجما) في ظل ظروف نهار طويل.
أُعيد تركيب الحمض النووي التكميلي GID1a المُدخل في البلازميد pDONR221 مع البلازميدين pDONR P4-P1R-pUBQ10 و pDONR P2R-P3-mCherry في البلازميد pB7m34GW لإنتاج pUBQ10::GID1a-mCherry. كما أُعيد تركيب الحمض النووي IDD2 المُدخل في البلازميد pDONR221 في البلازميد pB7RWG266 لإنتاج p35S:IDD2-RFP. لإنشاء pGID1b::2xmTQ2-GID1b، تم أولاً تضخيم جزء بطول 3.9 كيلوبايت في اتجاه التيار من منطقة ترميز GID1b وجزء بطول 4.7 كيلوبايت يحتوي على cDNA الخاص بـ GID1b (1.3 كيلوبايت) والمنهي (3.4 كيلوبايت) باستخدام البادئات في الجدول التكميلي 3، ثم تم إدخالها في pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) و pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) على التوالي، وأخيرًا تم إعادة تركيبها مع pDONR221 2xmTQ268 في ناقل الهدف pGreen 012567 باستخدام استنساخ Gateway. لإنتاج pCUC2::LSSmOrange، تم تجميع تسلسل محفز CUC2 (3229 زوجًا قاعديًا قبل ATG) متبوعًا بتسلسل ترميز LSSmOrange69 مع إشارة التموضع النووي N7 ومنهي النسخ NOS في ناقل استهداف الكاناميسين pGreen باستخدام نظام إعادة التركيب Gateway ثلاثي الأجزاء (Invitrogen). تم إدخال الناقل الثنائي النباتي إلى سلالة Agrobacterium tumefaciens GV3101، ثم إلى أوراق Nicotiana benthamiana باستخدام طريقة التسلل البكتيري، وإلى Arabidopsis thaliana Col-0 باستخدام طريقة غمر الأزهار. تم عزل pUBQ10::qmRGA وpUBQ10::GID1a-mCherry وpCLV3::mCherry-NLS qmRGA من الجيلين F3 وF1 من التهجينات المعنية، على التوالي.
أُجري التهجين الموضعي للحمض النووي الريبوزي (RNA) على أطراف براعم بطول 1 سم تقريبًا، حيث جُمعت وثُبِّتت فورًا في محلول FAA (3.7% فورمالدهيد، 5% حمض أسيتيك، 50% إيثانول) مُبرَّد مسبقًا إلى 4 درجات مئوية. بعد معالجتين بالتفريغ لمدة 15 دقيقة لكل منهما، تم تغيير المُثبِّت وحُضِّنت العينات طوال الليل. تم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) للجينات GID1a، وGID1b، وGID1c، وGAI، وRGL1، وRGL2، وRGL3، بالإضافة إلى مجسات مضادة للجينات في مناطقها غير المترجمة 3′ (3′-UTRs)، باستخدام البادئات الموضحة في الجدول التكميلي 3 كما وصفها روزير وآخرون. تم الكشف المناعي عن المجسات الموسومة بالديجوكسيجينين باستخدام الأجسام المضادة للديجوكسيجينين (تخفيف 3000 ضعف؛ روش، رقم الكتالوج: 11 093 274 910)، وتم تلوين المقاطع بمحلول 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات (BCIP، تخفيف 250 ضعف)/نيتروبلو تترازوليوم (NBT، تخفيف 200 ضعف).