يتم الحفاظ على بروتينات DELLAمنظمات النموالتي تلعب دورًا محوريًا في نمو النبات استجابةً للإشارات الداخلية والخارجية. بصفتها منظمات نسخية، ترتبط بروتينات DELLA بعوامل النسخ (TFs) والهيستون H2A عبر نطاقات GRAS الخاصة بها، وتُجنَّد للتأثير على المحفزات. أظهرت الدراسات الحديثة أن استقرار DELLA يُنظَّم بعد الترجمة بآليتين: تعدد اليوبيكويتين المُحفَّز بواسطة هرمون النباتالجبرلين، مما يؤدي إلى تحللها السريع، واقترانها بمُعدِّل صغير شبيه باليوبيكويتين (SUMO)، مما يزيد من تراكمها. علاوة على ذلك، يُنظَّم نشاط DELLA ديناميكيًا من خلال آليتين متميزتين للجليكوزيل: يُعزز التحلل الفوكوزي للأكسجين تفاعل DELLA مع عامل النسخ، بينما يُثبِّط تعديل N-أسيتيل الجلوكوزامين (O-GlcNAc) المرتبط بالأكسجين تفاعل DELLA مع عامل النسخ. مع ذلك، لا يزال دور فسفرة DELLA غير واضح، حيث أظهرت دراسات سابقة نتائج متضاربة، حيث يُشير بعضها إلى أن الفسفرة تُعزز أو تُثبِّط تحلل DELLA، بينما يُشير البعض الآخر إلى أن الفسفرة لا تؤثر على استقرارها. هنا، حددنا مواقع الفسفرة في مُثبِّط GA1-3 (RGA)، AtDELLA، المُنقّى من نبات أرابيدوبسيس ثاليانا باستخدام مطياف الكتلة، وأظهرنا أن فسفرة ببتيديْن من RGA في منطقتي PolyS وPolyS/T تُعزِّز نشاط RGA من خلال تعزيز ارتباط H2A وارتباط RGA بالمحفزات المستهدفة. والجدير بالذكر أن الفسفرة لم تؤثر على تفاعلات RGA مع عامل النسخ أو استقرار RGA. تكشف دراستنا عن آلية جزيئية تُحفِّز من خلالها الفسفرة نشاط DELLA.
كشف تحليل مطياف الكتلة لدينا أن كلاً من Pep1 وPep2 تم فسفرتهما بدرجة عالية في RGA في خلفية Ga1 التي تعاني من نقص GA. بالإضافة إلى هذه الدراسة، كشفت دراسات الفسفرة البروتينية أيضًا عن فسفرة Pep1 في RGA، على الرغم من أن دورها لم يُدرس بعد53،54،55. في المقابل، لم يتم وصف فسفرة Pep2 سابقًا حيث لا يمكن الكشف عن هذا الببتيد إلا باستخدام الجين المنقول RGAGKG. على الرغم من أن طفرة m1A، التي ألغت فسفرة Pep1، قللت نشاط RGA بشكل طفيف فقط في النبات، إلا أن لها تأثيرًا إضافيًا عند دمجها مع m2A في تقليل نشاط RGA (الشكل التكميلي 6). والأهم من ذلك، انخفض فسفرة Pep1 بشكل ملحوظ في الطفرة sly1 المعززة بـ GA مقارنةً بـ ga1، مما يشير إلى أن GA يعزز إزالة فسفرة RGA، مما يقلل من نشاطه. تتطلب آلية GA التي يثبط بها فسفرة RGA مزيدًا من البحث. أحد الاحتمالات هو أن ذلك يتحقق من خلال تنظيم بروتين كيناز غير محدد. على الرغم من أن الدراسات أظهرت أن التعبير عن بروتين كيناز CK1 EL1 يُقلل بواسطة حمض الجبريليك في الأرز41، إلا أن نتائجنا تشير إلى أن الطفرات عالية المستوى في نظير EL1 في نبات أرابيدوبسيس (AEL1-4) لا تقلل من فسفرة RGA. وبالتوافق مع نتائجنا، لم تُحدد دراسة فسفوبروتيومية حديثة باستخدام سلالات أرابيدوبسيس AEL مفرطة التعبير وطفرة ثلاثية في نبات أرابيدوبسيس أي بروتينات DELLA كركائز لهذه الكينازات56. عند إعدادنا للمخطوطة، أُفيد أن GSK3، الجين المُشفر لكيناز شبيه بـ GSK3/SHAGGY في القمح (Triticum aestivum)، يُمكنه فسفرة DELLA (Rht-B1b)57، على الرغم من عدم تأكيد فسفرة Rht-B1b بواسطة GSK3 في النبات. أظهرت التفاعلات الأنزيمية المختبرية بوجود GSK3، متبوعةً بتحليل مطياف الكتلة، وجود ثلاثة مواقع فسفرة تقع بين نطاقي DELLA وGRAS في بروتين Rht-B1b (الشكل التكميلي 3). أدى استبدال السيرين بالألانين في جميع مواقع الفسفرة الثلاثة إلى انخفاض نشاط Rht-B1b في القمح المعدّل وراثيًا، وهو ما يتوافق مع نتائجنا التي تُشير إلى أن استبدال الألانين في بروتين Pep2 RGA يُقلل من نشاط RGA. ومع ذلك، أظهرت اختبارات تحلل البروتين المختبرية أيضًا أن الفسفرة يُمكن أن تُثبّت بروتين Rht-B1b57. وهذا يتناقض مع نتائجنا التي تُشير إلى أن استبدال الألانين في بروتين Pep2 RGA لا يُؤثر على استقراره في النبات. GSK3 في القمح هو نظير لبروتين 2 غير الحساس للبراسينوستيرويد (BIN2) في نبات أرابيدوبسيس 57. BIN2 هو منظم سلبي لإشارات BR، ويقوم BR بتنشيط مسار إشارته عن طريق التسبب في تحلل BIN2 58. لقد أظهرنا أن معالجة BR لا تقلل من استقرار RGA 59 أو مستويات الفسفرة في نبات أرابيدوبسيس (الشكل التكميلي 2)، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن يتم فسفرة RGA بواسطة BIN2.
تم تحليل جميع البيانات الكمية إحصائيًا باستخدام برنامج إكسل، وحُددت الفروقات المهمة باستخدام اختبار t للطلاب. لم تُستخدم أي أساليب إحصائية لتحديد حجم العينة مسبقًا. لم تُستبعد أي بيانات من التحليل؛ ولم تُجرَ التجربة عشوائيًا؛ وكان الباحثون على دراية بالتوزيع أثناء التجربة وتقييم النتائج. تتوفر أحجام العينات في شرح الأشكال وفي ملفات البيانات الخام.
وقت النشر: ١٥ أبريل ٢٠٢٥