معدل الوفيات والسمية لمستحضرات السايبرمثرين التجارية للضفادع المائية الصغيرة

قامت هذه الدراسة بتقييم مدى فتك الأسلحة التجارية وقدرتها على القتل دون القتل والسمية.سايبرمثرينتركيبات لعلاج الضفادع عديمة الذنب. في الاختبار الحاد، تم اختبار تركيزات تتراوح بين 100 و800 ميكروغرام/لتر لمدة 96 ساعة. في الاختبار المزمن، تم اختبار تركيزات السيبرمثرين الطبيعية (1، 3، 6، و20 ميكروغرام/لتر) للتحقق من الوفيات، تلاها اختبار النواة الدقيقة وتشوهات نواة خلايا الدم الحمراء لمدة 7 أيام. بلغت LC50 لتركيبة السيبرمثرين التجارية لعلاج الضفادع 273.41 ميكروغرام/لتر. في الاختبار المزمن، أدى أعلى تركيز (20 ميكروغرام/لتر) إلى زيادة في معدل الوفيات بنسبة تزيد عن 50%، حيث قتل نصف الضفادع المختبرة. أظهر اختبار النواة الدقيقة نتائج مهمة عند 6 و20 ميكروغرام/لتر، وتم الكشف عن العديد من التشوهات النووية، مما يشير إلى أن تركيبة السيبرمثرين التجارية لها قدرة على التسبب في السمية الجينية ضد P. gracilis. يُشكل السيبرمثرين خطرًا كبيرًا على هذا النوع، مما يشير إلى أنه قد يُسبب مشاكل متعددة ويؤثر على ديناميكيات هذا النظام البيئي على المدى القصير والطويل. لذلك، يُمكن الاستنتاج أن تركيبات السيبرمثرين التجارية لها آثار سامة على P. gracilis.
بسبب التوسع المستمر في الأنشطة الزراعية والتطبيق المكثف للزراعةمكافحة الآفاتفي ظل الإجراءات المتخذة، تتعرض الحيوانات المائية بشكل متكرر للمبيدات الحشرية1،2. ويمكن أن يؤثر تلوث موارد المياه القريبة من الحقول الزراعية على نمو وبقاء الكائنات الحية غير المستهدفة، مثل البرمائيات.
تتزايد أهمية البرمائيات في تقييم المصفوفات البيئية. تُعتبر البرمائيات اللاسعة مؤشرات حيوية جيدة للملوثات البيئية نظرًا لخصائصها الفريدة، مثل دورات حياتها المعقدة، ومعدلات نمو يرقاتها السريعة، وحالتها الغذائية، وجلدها النفاذ10،11، واعتمادها على الماء للتكاثر12، وبيضها غير المحمي11،13،14. وقد ثبت أن ضفدع الماء الصغير (Physalaemus gracilis)، المعروف باسم الضفدع الباكي، نوعٌ من المؤشرات الحيوية على تلوث المبيدات الحشرية4،5،6،7،15. يوجد هذا النوع في المياه الراكدة، أو المناطق المحمية، أو المناطق ذات الموائل المتغيرة في الأرجنتين، وأوروغواي، وباراغواي، والبرازيل16،17، ويُعتبر مستقرًا وفقًا لتصنيف الاتحاد الدولي لحفظ الطبيعة نظرًا لانتشاره الواسع وتحمله للموائل المختلفة18.
تم الإبلاغ عن تأثيرات غير قاتلة على البرمائيات بعد التعرض للسايبرمثرين، بما في ذلك تغيرات سلوكية ومورفولوجية وكيميائية حيوية في الشراغيف23،24،25، وتغير في معدل الوفيات وزمن التحول، وتغيرات إنزيمية، وانخفاض في نجاح الفقس24،25، وفرط النشاط26، وتثبيط نشاط الكولينستراز27، وتغيرات في أداء السباحة7،28. ومع ذلك، فإن دراسات التأثيرات السمية الجينية للسايبرمثرين على البرمائيات محدودة. لذلك، من المهم تقييم مدى حساسية أنواع الأنوفران للسايبرمثرين.
يؤثر التلوث البيئي على النمو والتطور الطبيعي للبرمائيات، إلا أن أخطر الآثار السلبية هو التلف الجيني للحمض النووي الناتج عن التعرض للمبيدات الحشرية.13. يُعد تحليل مورفولوجيا خلايا الدم مؤشرًا حيويًا مهمًا للتلوث والسمية المحتملة لمادة ما على الأنواع البرية.29. يُعد اختبار النواة الدقيقة من أكثر الطرق شيوعًا لتحديد السمية الجينية للمواد الكيميائية في البيئة.30. إنها طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة، وتُمثل مؤشرًا جيدًا على التلوث الكيميائي للكائنات الحية مثل البرمائيات.31،32، ويمكن أن توفر معلومات عن التعرض للملوثات السامة للجينات.33.
كان الهدف من هذه الدراسة تقييم الإمكانات السامة لمستحضرات السايبرمثرين التجارية على الضفادع المائية الصغيرة باستخدام اختبار النواة الصغيرة وتقييم المخاطر البيئية.
معدل الوفيات التراكمي (%) لصغار P. gracilis المعرضة لتركيزات مختلفة من السايبرمثرين التجاري خلال الفترة الحادة من الاختبار.
معدل الوفيات التراكمي (%) لصغار P. gracilis المعرضة لتركيزات مختلفة من السايبرمثرين التجاري أثناء الاختبار المزمن.
نتج ارتفاع معدل الوفيات الملحوظ عن التأثيرات السامة للجينات في البرمائيات المعرضة لتركيزات مختلفة من السيبرمثرين (6 و20 ميكروغرام/لتر)، كما يتضح من وجود نوى دقيقة (MN) وتشوهات نووية في كريات الدم الحمراء. يشير تكوين النوى الدقيقة إلى أخطاء في الانقسام الفتيلي، ويرتبط بضعف ارتباط الكروموسومات بالأنابيب الدقيقة، وعيوب في المجمعات البروتينية المسؤولة عن امتصاص الكروموسومات ونقلها، وأخطاء في فصل الكروموسومات، وأخطاء في إصلاح تلف الحمض النووي (DNA)38،39، وقد يكون مرتبطًا بالإجهاد التأكسدي الناتج عن المبيدات الحشرية40،41. لوحظت تشوهات أخرى في جميع التركيزات التي تم تقييمها. أدت زيادة تركيزات السيبرمثرين إلى زيادة التشوهات النووية في كريات الدم الحمراء بنسبة 5% و20% عند أدنى جرعة (1 ميكروغرام/لتر) وأعلى جرعة (20 ميكروغرام/لتر) على التوالي. على سبيل المثال، يمكن أن تُسبب التغيرات في الحمض النووي (DNA) لنوع ما عواقب وخيمة على بقاء الأنواع على المدى القصير والطويل، مما يؤدي إلى انخفاض أعدادها، واختلال في لياقتها الإنجابية، وتزاوج الأقارب، وفقدان التنوع الجيني، وتغير في معدلات الهجرة. جميع هذه العوامل تؤثر على بقاء الأنواع واستمرارها42،43. قد يشير تكوين تشوهات الكريات الحمراء إلى عرقلة في انقسام السيتوبلازم، مما يؤدي إلى انقسام غير طبيعي للخلايا (كريات حمراء ثنائية النواة)44،45؛ النوى متعددة الفصوص هي نتوءات من الغشاء النووي ذات فصوص متعددة46، بينما قد ترتبط تشوهات أخرى في الكريات الحمراء بتضخم الحمض النووي، مثل الكلى/البثور النووية47. قد يشير وجود كريات حمراء عديمة النواة إلى ضعف في نقل الأكسجين، وخاصة في المياه الملوثة48،49. يشير موت الخلايا المبرمج إلى موت الخلايا50.
أظهرت دراسات أخرى أيضًا التأثيرات السامة للسايبرمثرين على الجينات. أظهر كابانيا وآخرون51 وجود نوى دقيقة وتغيرات نووية، مثل الخلايا ثنائية النواة والخلايا الميتة في خلايا أودونتوفرينوس أمريكانوس بعد التعرض لتركيزات عالية من السايبرمثرين (5000 و10000 ميكروغرام/لتر) لمدة 96 ساعة. كما رُصد موت الخلايا المبرمج المُستحث بالسايبرمثرين في P. biligonigerus52 وRhinella arenarum53. تشير هذه النتائج إلى أن السايبرمثرين له تأثيرات سامة للجينات على مجموعة من الكائنات المائية، وأن اختبار MN و ENA قد يكون مؤشرًا على تأثيرات غير مميتة على البرمائيات، وقد ينطبق على الأنواع المحلية والأنواع البرية المعرضة للمواد السامة12.
تشكل التركيبات التجارية للسايبرمثرين خطرًا بيئيًا كبيرًا (حادًا ومزمنًا)، حيث تتجاوز HQs مستوى وكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA)54 والذي قد يؤثر سلبًا على الأنواع إذا كانت موجودة في البيئة. في تقييم المخاطر المزمنة، بلغ NOEC للوفيات 3 ميكروغرام/لتر، مما يؤكد أن التركيزات الموجودة في الماء قد تشكل خطرًا على الأنواع55. بلغ NOEC القاتل ليرقات R. arenarum المعرضة لمزيج من الإندوسلفان والسايبرمثرين 500 ميكروغرام/لتر بعد 168 ساعة؛ وانخفضت هذه القيمة إلى 0.0005 ميكروغرام/لتر بعد 336 ساعة. يوضح المؤلفون أنه كلما طالت مدة التعرض، انخفضت التركيزات الضارة بالأنواع. ومن المهم أيضًا إبراز أن قيم NOEC كانت أعلى من تلك الخاصة بـ P. gracilis في نفس وقت التعرض، مما يشير إلى أن استجابة الأنواع للسايبرمثرين خاصة بكل نوع. علاوة على ذلك، من حيث معدل الوفيات، بلغت قيمة CHQ لـ P. gracilis بعد التعرض للسايبرمثرين 64.67، وهي أعلى من القيمة المرجعية التي حددتها وكالة حماية البيئة الأمريكية54، كما كانت قيمة CHQ ليرقات R. arenarum أعلى من هذه القيمة (CHQ > 388.00 بعد 336 ساعة)، مما يشير إلى أن المبيدات الحشرية المدروسة تشكل خطرًا كبيرًا على العديد من أنواع البرمائيات. وبالنظر إلى أن P. gracilis تحتاج إلى حوالي 30 يومًا لإكمال تحولها56، يمكن الاستنتاج أن تركيزات السايبرمثرين المدروسة قد تساهم في انخفاض أعدادها من خلال منع الأفراد المصابة من دخول مرحلة البلوغ أو التكاثر في سن مبكرة.
في تقييم المخاطر المحسوب للنوى الدقيقة وغيرها من التشوهات في نوى كريات الدم الحمراء، تراوحت قيم CHQ بين 14.92 و97.00، مما يشير إلى أن السيبرمثرين يُحتمل أن يُسبب سمية جينية لـ P. gracilis حتى في بيئته الطبيعية. مع الأخذ في الاعتبار معدل الوفيات، بلغ أقصى تركيز للمركبات الغريبة التي تتحملها P. gracilis 4.24 ميكروغرام/لتر. ومع ذلك، أظهرت تركيزات منخفضة تصل إلى 1 ميكروغرام/لتر آثارًا سمية جينية. قد يؤدي هذا إلى زيادة عدد الأفراد غير الطبيعية57، ويؤثر على نمو وتكاثر الأنواع في بيئاتها، مما يؤدي إلى انخفاض في أعداد البرمائيات.
أظهرت التركيبات التجارية لمبيد سايبرمثرين الحشري سمية حادة ومزمنة عالية لـ P. gracilis. ولوحظت معدلات وفيات أعلى، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تأثيرات سامة، كما يتضح من وجود تشوهات في النوى الدقيقة وخلايا الدم الحمراء، وخاصة النوى المسننة والنوى المفصصة والنوى الحويصلية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأنواع المدروسة مخاطر بيئية متزايدة، حادة ومزمنة. وأظهرت هذه البيانات، مقترنة بدراسات سابقة أجراها فريقنا البحثي، أنه حتى التركيبات التجارية المختلفة من سايبرمثرين لا تزال تسبب انخفاضًا في أنشطة الأستيل كولينستراز (AChE) والبيوتريل كولينستراز (BChE) والإجهاد التأكسدي58، وتؤدي إلى تغيرات في نشاط السباحة وتشوهات فموية59 في P. gracilis، مما يشير إلى أن التركيبات التجارية من سايبرمثرين لها سمية قاتلة وشبه قاتلة عالية لهذا النوع. هارتمان وآخرون. وجدت دراسة أن التركيبات التجارية من السيبرمثرين كانت الأكثر سميةً لـ P. gracilis ونوع آخر من الجنس نفسه (P. cuvieri) مقارنةً بتسعة مبيدات حشرية أخرى. يشير هذا إلى أن تركيزات السيبرمثرين المُعتمدة قانونيًا لحماية البيئة قد تؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفيات وانخفاض أعدادها على المدى الطويل.
هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم سُمية المبيد على البرمائيات، إذ قد تُسبب تركيزاته في البيئة معدلات نفوق عالية وتُشكل خطرًا مُحتملًا على طفيليات P. gracilis. ينبغي تشجيع البحث على أنواع البرمائيات، نظرًا لندرة البيانات المتعلقة بهذه الكائنات، وخاصةً تلك الموجودة في البرازيل.
استمر اختبار السمية المزمنة لمدة 168 ساعة (7 أيام) في ظروف ثابتة، وكانت التركيزات دون المميتة: 1، 3، 6، و20 ميكروغرام من المادة الفعالة/لتر. في كلتا التجربتين، تم تقييم 10 شراغيف لكل مجموعة معالجة بستة مكررات، ليصل إجمالي عدد الشراغيف لكل تركيز إلى 60 شراغيفًا. في هذه الأثناء، كانت المعالجة بالماء فقط بمثابة ضابط سلبي. تألف كل إعداد تجريبي من طبق زجاجي معقم بسعة 500 مل وكثافة شراغيف واحد لكل 50 مل من المحلول. غُطيت القارورة بغشاء بولي إيثيلين لمنع التبخر، وجرى تهويتها باستمرار.
تم تحليل الماء كيميائيًا لتحديد تركيزات المبيدات عند ٠، ٩٦، و١٦٨ ساعة. ووفقًا لسابين وآخرون ٦٨ ومارتينز وآخرون ٦٩، أُجريت التحليلات في مختبر تحليل المبيدات (LARP) التابع للجامعة الفيدرالية في سانتا ماريا باستخدام كروماتوغرافيا الغاز المقترنة بمطياف الكتلة الرباعي الثلاثي (نموذج فاريان ١٢٠٠، بالو ألتو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). ويُعرض التحديد الكمي للمبيدات في الماء كمواد تكميلية (الجدول SM١).
لاختبار النواة الدقيقة (MNT) واختبار شذوذ نواة خلايا الدم الحمراء (RNA)، تم تحليل 15 شرغوفًا من كل مجموعة علاجية. خُدِّرت الشرغوف باستخدام ليدوكايين 5% (50 ملغ جم-170)، وجُمعت عينات الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام محاقن هيبارينية تُستعمل لمرة واحدة. حُضِّرت لطاخات الدم على شرائح مجهرية معقمة، وجُفِّفت بالهواء، ثُبِّتت بميثانول 100% (4 درجات مئوية) لمدة دقيقتين، ثم صُبِّغت بمحلول جيمسا 10% لمدة 15 دقيقة في الظلام. في نهاية العملية، غُسلت الشرائح بالماء المقطر لإزالة الصبغة الزائدة، وجُفِّفت في درجة حرارة الغرفة.
تم تحليل ما لا يقل عن 1000 خلية دم حمراء من كل شرغوف باستخدام مجهر 100 × مع هدف 71 لتحديد وجود MN و ENA. تم تقييم ما مجموعه 75796 خلية دم حمراء من الشرغوف مع الأخذ في الاعتبار تركيزات السايبرمثرين وضوابطها. تم تحليل السمية الجينية وفقًا لطريقة كاراسكو وآخرون وفينيش وآخرون.38،72 من خلال تحديد وتيرة الآفات النووية التالية: (1) الخلايا عديمة النواة: الخلايا بدون نوى؛ (2) الخلايا المبرمجة للموت الخلوي: التفتت النووي، موت الخلايا المبرمج؛ (3) الخلايا ثنائية النواة: الخلايا ذات النواة؛ (4) البراعم النووية أو الخلايا الفقاعية: الخلايا ذات النوى مع نتوءات صغيرة من الغشاء النووي، فقاعات مماثلة في الحجم للنوى الدقيقة؛ (5) الخلايا المتحللة نوويًا: الخلايا التي تحتوي فقط على محيط النواة بدون مادة داخلية؛ (٦) خلايا مُسننة: خلايا ذات أنوية ذات شقوق أو شقوق واضحة في شكلها، وتُسمى أيضًا أنوية كلية الشكل؛ (٧) خلايا مُفصصة: خلايا ذات نتوءات نووية أكبر من الحويصلات المذكورة سابقًا؛ و(٨) خلايا دقيقة: خلايا ذات أنوية مُكثفة وسيتوبلازم مُختزل. قورنت التغييرات بنتائج الضبط السلبية.
تم تحليل نتائج اختبار السمية الحادة (LC50) باستخدام برنامج GBasic وطريقة TSK-Trimmed Spearman-Karber74. وخضعت بيانات الاختبار المزمن لاختبارات مسبقة للتحقق من ثبات الخطأ (Shapiro-Wilks) وتجانس التباين (Bartlett). كما تم تحليل النتائج باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). واستُخدم اختبار Tukey لمقارنة البيانات، واختبار Dunnett لمقارنة البيانات بين مجموعة العلاج ومجموعة الضبط السلبية.
تم تحليل بيانات LOEC وNOEC باستخدام اختبار دونيت. وأُجريت الاختبارات الإحصائية باستخدام برنامج Statistica 8.0 (StatSoft) بمستوى دلالة إحصائية 95% (p < 0.05).