تحديد عوامل تنظيم نمو الخردل وتحليل التعبير عنها على مستوى الجينوم في ظل ظروف الجفاف

التوزيع الموسمي لهطول الأمطار في مقاطعة قويتشو غير متساوٍ، حيث يزداد هطول الأمطار في الربيع والصيف، إلا أن شتلات بذور اللفت معرضة لإجهاد الجفاف في الخريف والشتاء، مما يؤثر بشكل خطير على المحصول. الخردل محصول زيتي خاص يُزرع بشكل رئيسي في مقاطعة قويتشو. يتميز بقدرة عالية على تحمل الجفاف ويمكن زراعته في المناطق الجبلية. وهو مصدر غني بالجينات المقاومة للجفاف. يُعد اكتشاف الجينات المقاومة للجفاف أمرًا بالغ الأهمية لتحسين أصناف الخردل والابتكار في موارد البلازما الجرثومية. تلعب عائلة GRF دورًا حاسمًا في نمو النبات وتطوره والاستجابة لإجهاد الجفاف. في الوقت الحالي، تم العثور على جينات GRF في نبات الأرابيدوبسيس 2، والأرز (أوريزا ساتيفا) 12، وبذور اللفت 13، والقطن (جوسيبيوم هيرسوتوم) 14، والقمح (تريتيكوم. أستيفوم) 15، والدخن اللؤلؤي (سيتاريا إيتاليكا) 16، والبراسيكا 17، ولكن لا توجد تقارير عن اكتشاف جينات GRF في الخردل. في هذه الدراسة، حُددت جينات عائلة GRF للخردل على مستوى الجينوم، وحُللت خصائصها الفيزيائية والكيميائية، وعلاقاتها التطورية، وتشابهها، وأنماطها المحفوظة، وبنيتها الجينية، وتضاعفاتها، وعناصرها السيسية، ومرحلة الشتلات (مرحلة الأوراق الأربع). وحُللت أنماط التعبير الجيني تحت ضغط الجفاف بشكل شامل لتوفير أساس علمي لمزيد من الدراسات حول الوظيفة المحتملة لجينات BjGRF في الاستجابة للجفاف، ولتوفير جينات مرشحة لتربية خردل مقاوم للجفاف.
تم تحديد أربعة وثلاثين جينًا من جينات BjGRF في جينوم Brassica juncea باستخدام بحثين من نوع HMMER، وتحتوي جميعها على نطاقي QLQ وWRC. وترد تسلسلات CDS لجينات BjGRF المحددة في الجدول التكميلي S1. وسُمِّيت جينات BjGRF01–BjGRF34 بناءً على موقعها على الكروموسوم. وتشير الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه العائلة إلى أن طول الأحماض الأمينية متغير للغاية، ويتراوح من 261 حمض أميني (BjGRF19) إلى 905 حمض أميني (BjGRF28). وتتراوح نقطة التساوي الكهربائي لـ BjGRF من 6.19 (BjGRF02) إلى 9.35 (BjGRF03) بمتوسط ​​8.33، ويُشكل بروتين BjGRF الأساسي نسبة 88.24%. يتراوح الوزن الجزيئي المتوقع لـ BjGRF من 29.82 كيلو دالتون (BjGRF19) إلى 102.90 كيلو دالتون (BjGRF28)؛ يتراوح مؤشر عدم استقرار بروتينات BjGRF من 51.13 (BjGRF08) إلى 78.24 (BjGRF19)، وكلها أكبر من 40، مما يشير إلى أن مؤشر الأحماض الدهنية يتراوح من 43.65 (BjGRF01) إلى 78.78 (BjGRF22)، يتراوح متوسط ​​محبة الماء (GRAVY) من -1.07 (BjGRF31) إلى -0.45 (BjGRF22)، جميع بروتينات BjGRF المحبة للماء لها قيم GRAVY سلبية، والتي قد تكون بسبب نقص كراهية الماء الناجم عن البقايا. أظهر التنبؤ بالتوطين الفرعي للخلية أن 31 بروتينًا مشفرًا بواسطة BjGRF يمكن توطينه في النواة، ويمكن توطين BjGRF04 في البيروكسيسومات، ويمكن توطين BjGRF25 في السيتوبلازم، ويمكن توطين BjGRF28 في البلاستيدات الخضراء (الجدول 1)، مما يشير إلى أن BjGRFs قد تكون موضعية في النواة وتلعب دورًا تنظيميًا مهمًا كعامل نسخ.
يمكن أن يساعد التحليل التطوري لعائلات GRF في الأنواع المختلفة في دراسة وظائف الجينات. لذلك، تم تنزيل تسلسلات الأحماض الأمينية كاملة الطول لـ 35 جينًا من بذور اللفت و16 جينًا من اللفت و12 جينًا من الأرز و10 جينات من الدخن و9 جينات من نبات الأرابيدوبسيس، وتم بناء شجرة تطورية بناءً على 34 جينًا من جينات BjGRF المحددة (الشكل 1). تحتوي الفصائل الفرعية الثلاث على أعداد مختلفة من الأعضاء؛ حيث تنقسم 116 جينًا من جينات GRF إلى ثلاث فصائل فرعية مختلفة (المجموعات A ~ C)، تحتوي على 59 (50.86%) و34 (29.31%) و23 (19.83)% من جينات GRF على التوالي. من بينها، يتوزع 34 عضوًا من عائلة BjGRF على 3 فصائل فرعية: 13 عضوًا في المجموعة A (38.24%) و12 عضوًا في المجموعة B (35.29%) و9 أعضاء في المجموعة C (26.47%). في عملية تعدد الصبغيات في نبات الخردل، يختلف عدد جينات BjGRFs في الفصائل الفرعية المختلفة، وقد يكون هناك تضخيم أو فقدان للجينات. تجدر الإشارة إلى عدم وجود توزيع لجينات BjGRFs في الأرز والدخن في المجموعة ج، بينما يوجد جينان من الأرز وواحد من الدخن في المجموعة ب، وتُجمع معظم جينات BjGRFs في فرع واحد، مما يشير إلى أن BjGRFs وثيقة الصلة بالنباتات ثنائية الفلقة. من بين هذه الدراسات، تُوفر الدراسات الأكثر تعمقًا حول وظيفة GRF في نبات أرابيدوبسيس ثاليانا أساسًا للدراسات الوظيفية لجينات BjGRFs.
شجرة الخردل التطورية التي تشمل Brassica napus، وBrassica napus، والأرز، والدخن، وأعضاء عائلة Arabidopsis thaliana GRF.
تحليل الجينات المتكررة في عائلة GRF للخردل. يمثل الخط الرمادي في الخلفية كتلة متزامنة في جينوم الخردل، بينما يمثل الخط الأحمر زوجًا من التكرارات المجزأة لجين BjGRF.
التعبير الجيني لجين BjGRF تحت ضغط الجفاف في المرحلة الرابعة من الورقة. تظهر بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (qRT-PCR) في الجدول التكميلي S5. يُشار إلى الاختلافات المهمة في البيانات بأحرف صغيرة.
مع استمرار تغير المناخ العالمي، أصبحت دراسة كيفية تأقلم المحاصيل مع إجهاد الجفاف وتحسين آليات تحمّلها موضوعًا بحثيًا هامًا18. بعد الجفاف، يتغير التركيب المورفولوجي والتعبير الجيني والعمليات الأيضية للنباتات، مما قد يؤدي إلى توقف عملية التمثيل الضوئي واضطراب التمثيل الغذائي، مما يؤثر على إنتاجية وجودة المحاصيل19،20،21. عندما تستشعر النباتات إشارات الجفاف، فإنها تُنتج رسلًا ثانوية مثل Ca2+ وفوسفاتيديلينوسيتول، مما يزيد من تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلايا، ويُنشّط الشبكة التنظيمية لمسار فسفرة البروتين22،23. يشارك البروتين المستهدف النهائي بشكل مباشر في الدفاع الخلوي أو يُنظّم التعبير عن جينات الإجهاد ذات الصلة من خلال عوامل النسخ، مما يُعزز تحمّل النبات للإجهاد24،25. وبالتالي، تلعب عوامل النسخ دورًا حاسمًا في الاستجابة لإجهاد الجفاف. ووفقًا لتسلسل وخصائص ارتباط عوامل النسخ المستجيبة لإجهاد الجفاف بالحمض النووي، يمكن تقسيم عوامل النسخ إلى عائلات مختلفة، مثل GRF وERF وMYB وWRKY وعائلات أخرى26.
عائلة جينات GRF هي نوع من عوامل النسخ الخاصة بالنباتات، وتلعب أدوارًا مهمة في جوانب مختلفة، مثل النمو والتطور ونقل الإشارات واستجابات الدفاع النباتي.27. منذ اكتشاف أول جين GRF في نبات O. sativa.28، تزايدت أعداد جينات GRF في العديد من الأنواع، وتبين أنها تؤثر على نمو النبات وتطوره واستجابته للإجهاد.8، 29، 30، 31، 32. مع نشر تسلسل جينوم نبات Brassica juncea، أصبح من الممكن تحديد عائلة جينات BjGRF.33. في هذه الدراسة، تم تحديد 34 جينًا من جينات BjGRF في جينوم الخردل الكامل، وتمت تسميتها BjGRF01-BjGRF34 بناءً على موقعها الكروموسومي. تحتوي جميعها على نطاقات QLQ وWRC عالية الحفظ. أظهر تحليل الخصائص الفيزيائية والكيميائية أن الاختلافات في أعداد الأحماض الأمينية والأوزان الجزيئية لبروتينات BjGRF (باستثناء BjGRF28) لم تكن ذات دلالة إحصائية، مما يشير إلى أن أعضاء عائلة BjGRF قد يكون لديهم وظائف متشابهة. أظهر تحليل بنية الجينات أن 64.7٪ من جينات BjGRF تحتوي على 4 إكسونات، مما يشير إلى أن بنية جين BjGRF محفوظة نسبيًا في التطور، ولكن عدد الإكسونات في جينات BjGRF10 وBjGRF16 وBjGRP28 وBjGRF29 أكبر. أظهرت الدراسات أن إضافة أو حذف الإكسونات أو الإنترونات يمكن أن يؤدي إلى اختلافات في بنية الجينات ووظيفتها، وبالتالي إنشاء جينات جديدة34،35،36. لذلك، نتكهن بأن إنترون BjGRF قد فُقد أثناء التطور، مما قد يسبب تغييرات في وظيفة الجين. وتماشيًا مع الدراسات الحالية، وجدنا أيضًا أن عدد الإنترونات كان مرتبطًا بالتعبير الجيني. عندما يكون عدد الإنترونات في الجين كبيرًا، يمكن للجين الاستجابة بسرعة لعوامل غير مواتية مختلفة.
يُعدّ تكرار الجينات عاملاً رئيسياً في التطور الجيني والوراثي37. وقد أظهرت دراسات ذات صلة أن تكرار الجينات لا يزيد فقط من عدد جينات GRF، بل يُشكّل أيضاً وسيلةً لتوليد جينات جديدة لمساعدة النباتات على التكيف مع مختلف الظروف البيئية المعاكسة38. وُجد في هذه الدراسة 48 زوجاً من الجينات المكررة، جميعها تكرارات قطعية، مما يشير إلى أن التكرارات القطعية هي الآلية الرئيسية لزيادة عدد الجينات في هذه العائلة. وقد أفادت الدراسات أن التكرار القطعي يمكن أن يعزز بفعالية تضخيم أعضاء عائلة جين GRF في نبات الأرابيدوبسيس والفراولة، ولم يُعثر على أي تكرار مترادف لهذه العائلة الجينية في أيٍّ من النوعين27،39. وتتوافق نتائج هذه الدراسة مع الدراسات الحالية التي أُجريت على نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا وعائلتي الفراولة، مما يشير إلى أن عائلة GRF يمكنها زيادة عدد الجينات وتوليد جينات جديدة من خلال التكرار القطعي في نباتات مختلفة.
في هذه الدراسة، تم تحديد ما مجموعه 34 جينًا من جينات BjGRF في الخردل، والتي تم تقسيمها إلى 3 عائلات فرعية. أظهرت هذه الجينات أنماطًا محفوظة وهياكل جينية متشابهة. كشف تحليل الترابط الخطي عن 48 زوجًا من تكرارات القطع في الخردل. تحتوي منطقة محفز BjGRF على عناصر سيس-أكتينغ مرتبطة بالاستجابة للضوء والاستجابة الهرمونية والاستجابة للإجهاد البيئي والنمو والتطور. تم الكشف عن التعبير عن 34 جينًا من جينات BjGRF في مرحلة شتلة الخردل (الجذور والسيقان والأوراق)، ونمط التعبير عن 10 جينات من جينات BjGRF في ظل ظروف الجفاف. وقد وجد أن أنماط التعبير عن جينات BjGRF تحت ضغط الجفاف كانت متشابهة وقد تكون متشابهة. المشاركة في تنظيم إجبار الجفاف. قد تلعب جينات BjGRF03 وBjGRF32 أدوارًا تنظيمية إيجابية في إجهاد الجفاف، بينما تلعب جينات BjGRF06 وBjGRF23 أدوارًا في إجهاد الجفاف كجينات مستهدفة لـ miR396. بشكل عام، توفر دراستنا أساسًا بيولوجيًا لاكتشاف وظيفة جين BjGRF في نباتات الفصيلة الصليبية في المستقبل.
تم توفير بذور الخردل المستخدمة في هذه التجربة من قِبل معهد قويتشو لأبحاث البذور الزيتية، التابع لأكاديمية قويتشو للعلوم الزراعية. تم اختيار البذور كاملةً وزراعتها في التربة (نسبة الركيزة: التربة = 3:1)، ثم جمع الجذور والسيقان والأوراق بعد مرحلة نمو الأوراق الأربع. عولجت النباتات بـ 20% من PEG 6000 لمحاكاة الجفاف، وجُمعت الأوراق بعد 0، 3، 6، 12، و24 ساعة. جُمدت جميع عينات النباتات فورًا في النيتروجين السائل، ثم حُفظت في مُجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية للاختبار التالي.
تم تضمين جميع البيانات التي تم الحصول عليها أو تحليلها خلال هذه الدراسة في المقالة المنشورة وملفات المعلومات التكميلية.