تحديد وتحليل التعبير الجيني لعوامل تنظيم نمو الخردل في ظروف الجفاف

يتسم التوزيع الموسمي لهطول الأمطار في مقاطعة قويتشو بعدم الانتظام، حيث تهطل كميات أكبر في فصلي الربيع والصيف، إلا أن شتلات اللفت معرضة للإجهاد الناتج عن الجفاف في فصلي الخريف والشتاء، مما يؤثر سلبًا على المحصول. يُعد الخردل محصولًا زيتيًا مميزًا يُزرع بشكل رئيسي في مقاطعة قويتشو، ويتميز بتحمله العالي للجفاف وقدرته على النمو في المناطق الجبلية، مما يجعله مصدرًا غنيًا بالجينات المقاومة للجفاف. يُعد اكتشاف هذه الجينات ذا أهمية بالغة لتحسين أصناف الخردل وتطوير موارد البلازما الجرثومية. تلعب عائلة جينات GRF دورًا محوريًا في نمو النبات وتطوره واستجابته للإجهاد الناتج عن الجفاف. وقد تم العثور على جينات GRF في نبات الرشاد (Arabidopsis thaliana)، والأرز (Oryza sativa)، واللفت، والقطن (Gossypium hirsutum)، والقمح (Triticum aestivum)، والدخن اللؤلؤي (Setaria italica)، والكرنب (Brassica)، ولكن لم تُسجل أي تقارير عن اكتشاف جينات GRF في الخردل. في هذه الدراسة، تم تحديد جينات عائلة GRF في الخردل على مستوى الجينوم، وجرى تحليل خصائصها الفيزيائية والكيميائية، وعلاقاتها التطورية، وتماثلها، ووحداتها المحفوظة، وبنيتها الجينية، وتضاعفاتها، وعناصرها التنظيمية، ومرحلة نمو الشتلات (مرحلة الأربع أوراق). كما تم تحليل أنماط التعبير الجيني تحت ظروف الإجهاد الناتج عن الجفاف بشكل شامل لتوفير أساس علمي لدراسات لاحقة حول الوظيفة المحتملة لجينات BjGRF في الاستجابة للجفاف، ولتوفير جينات مرشحة لتربية أصناف خردل مقاومة للجفاف.
تم تحديد أربعة وثلاثين جينًا من عائلة BjGRF في جينوم Brassica juncea باستخدام بحثين في برنامج HMMER، وتحتوي جميعها على نطاقي QLQ وWRC. تُعرض تسلسلات CDS لجينات BjGRF المحددة في الجدول التكميلي S1. تمت تسمية BjGRF01 إلى BjGRF34 بناءً على موقعها على الكروموسوم. تشير الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه العائلة إلى أن طول الأحماض الأمينية فيها شديد التباين، حيث يتراوح من 261 حمضًا أمينيًا (BjGRF19) إلى 905 أحماض أمينية (BjGRF28). تتراوح نقطة التعادل الكهربائي لـ BjGRF من 6.19 (BjGRF02) إلى 9.35 (BjGRF03) بمتوسط ​​8.33، ويُشكل البروتين القاعدي 88.24% من بروتين BjGRF. يتراوح الوزن الجزيئي المتوقع لبروتين BjGRF من 29.82 كيلو دالتون (BjGRF19) إلى 102.90 كيلو دالتون (BjGRF28)؛ ويتراوح مؤشر عدم استقرار بروتينات BjGRF من 51.13 (BjGRF08) إلى 78.24 (BjGRF19)، وجميعها أكبر من 40، مما يشير إلى أن مؤشر الأحماض الدهنية يتراوح من 43.65 (BjGRF01) إلى 78.78 (BjGRF22)، ويتراوح متوسط ​​المحبة للماء (GRAVY) من -1.07 (BjGRF31) إلى -0.45 (BjGRF22)، وجميع بروتينات BjGRF المحبة للماء لها قيم GRAVY سالبة، وهو ما قد يكون بسبب نقص الكراهية للماء الناتج عن البقايا. أظهر التنبؤ بالتوطين تحت الخلوي أن 31 بروتينًا مشفرًا بواسطة BjGRF يمكن أن يتم توطينها في النواة، ويمكن توطين BjGRF04 في البيروكسيسومات، ويمكن توطين BjGRF25 في السيتوبلازم، ويمكن توطين BjGRF28 في البلاستيدات الخضراء (الجدول 1)، مما يشير إلى أن BjGRFs قد يتم توطينها في النواة وتلعب دورًا تنظيميًا مهمًا كعامل نسخ.
يُساعد التحليل التطوري لعائلات عوامل النسخ المرتبطة بالجينات (GRF) في مختلف الأنواع على دراسة وظائف الجينات. ولذلك، تم تنزيل تسلسلات الأحماض الأمينية الكاملة لـ 35 عامل نسخ مرتبط بالجينات من بذور اللفت، و16 من اللفت، و12 من الأرز، و10 من الدخن، و9 من نبات الرشاد (Arabidopsis)، وتم بناء شجرة تطورية استنادًا إلى 34 جينًا من عائلة BjGRF (الشكل 1). تحتوي العائلات الفرعية الثلاث على أعداد مختلفة من الأعضاء؛ حيث تم تقسيم 116 عامل نسخ مرتبط بالجينات إلى ثلاث عائلات فرعية مختلفة (المجموعات من أ إلى ج)، تحتوي على 59 (50.86%)، و34 (29.31%)، و23 (19.83%) من عوامل النسخ المرتبطة بالجينات، على التوالي. ومن بينها، تتوزع 34 عضوًا من عائلة BjGRF على 3 عائلات فرعية: 13 عضوًا في المجموعة أ (38.24%)، و12 عضوًا في المجموعة ب (35.29%)، و9 أعضاء في المجموعة ج (26.47%). في عملية تضاعف الصبغيات في الخردل، يختلف عدد جينات BjGRFs في العائلات الفرعية المختلفة، وقد يحدث تضخيم جيني وفقدان للجينات. ومن الجدير بالذكر أنه لا يوجد توزيع لجينات GRFs الخاصة بالأرز والدخن في المجموعة C، بينما يوجد جينان GRFs خاصان بالأرز وجين GRF واحد خاص بالدخن في المجموعة B، ومعظم جينات GRFs الخاصة بالأرز والدخن متجمعة في فرع واحد، مما يشير إلى أن جينات BjGRFs وثيقة الصلة بذوات الفلقتين. ومن بينها، توفر الدراسات الأكثر تعمقًا حول وظيفة GRF في نبات رشاد أذن الفأر (Arabidopsis thaliana) أساسًا للدراسات الوظيفية لجينات BjGRFs.
شجرة تطورية للخردل تشمل Brassica napus و Brassica napus والأرز والدخن وأفراد عائلة GRF من نبات Arabidopsis thaliana.
تحليل الجينات المتكررة في عائلة GRF في الخردل. يمثل الخط الرمادي في الخلفية كتلة متزامنة في جينوم الخردل، ويمثل الخط الأحمر زوجًا من التكرارات المجزأة لجين BjGRF؛
التعبير الجيني لـ BjGRF تحت ظروف الإجهاد الناتج عن الجفاف في مرحلة الورقة الرابعة. بيانات qRT-PCR معروضة في الجدول التكميلي S5. يُشار إلى الاختلافات الهامة في البيانات بأحرف صغيرة.
مع استمرار تغير المناخ العالمي، أصبحت دراسة كيفية تعامل المحاصيل مع إجهاد الجفاف وتحسين آليات تحملها موضوعًا بحثيًا هامًا¹⁸. فبعد الجفاف، تتغير البنية المورفولوجية والتعبير الجيني والعمليات الأيضية للنباتات، مما قد يؤدي إلى توقف عملية التمثيل الضوئي واضطراب الأيض، وبالتالي التأثير على إنتاجية وجودة المحاصيل^19،20،21. عندما تستشعر النباتات إشارات الجفاف، فإنها تُنتج رسلًا ثانوية مثل أيونات الكالسيوم (Ca2+) والفوسفاتيديل إينوزيتول، مما يزيد من تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلايا ويُفعّل الشبكة التنظيمية لمسار فسفرة البروتين^22،23. ويشارك البروتين المستهدف النهائي بشكل مباشر في الدفاع الخلوي أو يُنظم التعبير عن جينات الإجهاد ذات الصلة من خلال عوامل النسخ، مما يُعزز تحمل النبات للإجهاد^24،25. لذا، تلعب عوامل النسخ دورًا حاسمًا في الاستجابة لإجهاد الجفاف. وبناءً على تسلسل وخصائص ارتباط الحمض النووي لعوامل النسخ المستجيبة لإجهاد الجفاف، يمكن تقسيم عوامل النسخ إلى عائلات مختلفة، مثل GRF وERF وMYB وWRKY وغيرها²⁶.
تُعدّ عائلة جينات GRF نوعًا من عوامل النسخ النباتية المتخصصة، والتي تلعب أدوارًا مهمة في جوانب متعددة، مثل النمو والتطور ونقل الإشارات والاستجابات الدفاعية للنبات²⁷. منذ تحديد أول جين GRF في نبات الأرز (Oryza sativa)²⁸، تم تحديد المزيد من جينات GRF في العديد من الأنواع، وثبت تأثيرها على نمو النبات وتطوره واستجابته للإجهاد^{8، 29، 30، 31، 32}. مع نشر تسلسل جينوم الخردل الهندي (Brassica juncea)، أصبح تحديد عائلة جينات BjGRF ممكنًا³³. في هذه الدراسة، تم تحديد 34 جينًا من عائلة BjGRF في جينوم الخردل بأكمله، وسُميت BjGRF01–BjGRF34 بناءً على موقعها الكروموسومي. تحتوي جميعها على نطاقات QLQ وWRC محفوظة بدرجة عالية. أظهر تحليل الخصائص الفيزيائية والكيميائية أن الاختلافات في عدد الأحماض الأمينية والأوزان الجزيئية لبروتينات BjGRF (باستثناء BjGRF28) لم تكن ذات دلالة إحصائية، مما يشير إلى أن أفراد عائلة BjGRF قد يكون لهم وظائف متشابهة. وأظهر تحليل بنية الجينات أن 64.7% من جينات BjGRF تحتوي على 4 إكسونات، مما يدل على أن بنية جينات BjGRF محفوظة نسبيًا عبر التطور، إلا أن عدد الإكسونات في جينات BjGRF10 وBjGRF16 وBjGRP28 وBjGRF29 أكبر. وقد أظهرت الدراسات أن إضافة أو حذف الإكسونات أو الإنترونات يمكن أن يؤدي إلى اختلافات في بنية الجين ووظيفته، وبالتالي نشوء جينات جديدة^34،35،36. لذلك، نفترض أن الإنترون في BjGRF قد فُقد خلال التطور، مما قد يُسبب تغييرات في وظيفة الجين. وتماشيًا مع الدراسات السابقة، وجدنا أيضًا أن عدد الإنترونات مرتبط بالتعبير الجيني. عندما يكون عدد الإنترونات في الجين كبيرًا، يمكن للجين أن يستجيب بسرعة لمختلف العوامل غير المواتية.
يُعدّ تضاعف الجينات عاملاً رئيسياً في التطور الجينومي والوراثي³⁷. وقد أظهرت دراسات ذات صلة أن تضاعف الجينات لا يزيد فقط من عدد جينات GRF، بل يُعدّ أيضاً وسيلة لتوليد جينات جديدة تُساعد النباتات على التكيف مع مختلف الظروف البيئية المعاكسة³⁸. وقد وُجد في هذه الدراسة 48 زوجاً من الجينات المكررة، جميعها عبارة عن تضاعفات قطاعية، مما يُشير إلى أن التضاعفات القطاعية هي الآلية الرئيسية لزيادة عدد الجينات في هذه العائلة. وقد ذُكر في الأدبيات العلمية أن التضاعف القطاعي يُمكن أن يُعزز بشكل فعال تضخيم أفراد عائلة جينات GRF في نبات الرشاد (Arabidopsis thaliana) والفراولة، ولم يُعثر على أي تضاعف متسلسل لهذه العائلة الجينية في أي من النوعين^27،39. وتتفق نتائج هذه الدراسة مع الدراسات الموجودة على عائلتي جينات الرشاد والفراولة، مما يُشير إلى أن عائلة GRF يُمكن أن تزيد من عدد الجينات وتُولد جينات جديدة من خلال التضاعف القطاعي في نباتات مختلفة.
في هذه الدراسة، تم تحديد 34 جينًا من عائلة BjGRF في نبات الخردل، وقُسّمت إلى 3 عائلات فرعية. أظهرت هذه الجينات أنماطًا محفوظة متشابهة وبنية جينية متماثلة. وكشف تحليل التوافق الجيني عن 48 زوجًا من تكرارات القطع في نبات الخردل. تحتوي منطقة مُحفِّز جينات BjGRF على عناصر تنظيمية مرتبطة بالاستجابة للضوء، والاستجابة الهرمونية، والاستجابة للإجهاد البيئي، والنمو والتطور. تم رصد التعبير عن 34 جينًا من عائلة BjGRF في مرحلة بادرات الخردل (الجذور، السيقان، الأوراق)، ونمط التعبير عن 10 جينات منها في ظروف الجفاف. ووجد أن أنماط التعبير عن جينات BjGRF في ظروف الجفاف متشابهة، وقد يكون لها دورٌ في تنظيم استجابة النبات للجفاف. قد يلعب الجينان BjGRF03 وBjGRF32 أدوارًا تنظيمية إيجابية في استجابة النبات للجفاف، بينما يلعب الجينان BjGRF06 وBjGRF23 أدوارًا في استجابة النبات للجفاف كجينات مستهدفة لـ miR396. بشكل عام، توفر دراستنا أساسًا بيولوجيًا لاكتشاف وظيفة جين BjGRF في نباتات الفصيلة الصليبية في المستقبل.
تم الحصول على بذور الخردل المستخدمة في هذه التجربة من معهد بحوث بذور الزيت التابع لأكاديمية قويتشو للعلوم الزراعية. تم اختيار البذور الكاملة وزراعتها في التربة (نسبة التربة إلى الركيزة 3:1)، ثم جُمعت الجذور والسيقان والأوراق بعد ظهور أربع أوراق. عُولجت النباتات بمحلول بولي إيثيلين جلايكول 6000 بتركيز 20% لمحاكاة الجفاف، وجُمعت الأوراق بعد 0 و3 و6 و12 و24 ساعة. جُمدت جميع عينات النباتات فورًا في النيتروجين السائل، ثم حُفظت في مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية لإجراء الاختبار التالي.
جميع البيانات التي تم الحصول عليها أو تحليلها خلال هذه الدراسة مدرجة في المقالة المنشورة وملفات المعلومات التكميلية.