مواد نباتية ومسببة للأمراض
تم توفير مجموعة من سلالات الذرة الرفيعة المُعدّلة وراثيًا (SCP) من قِبل الدكتور بات براون في جامعة إلينوي (التي تعمل حاليًا في جامعة كاليفورنيا في ديفيس). وقد وُصفت هذه المجموعة سابقًا، وهي عبارة عن مجموعة من السلالات المتنوعة التي تم تحويلها لتصبح غير حساسة لفترة الإضاءة وأقصر قامةً لتسهيل نمو وتطور النباتات في البيئات الأمريكية. استُخدمت 510 سلالات من هذه المجموعة في هذه الدراسة، ولكن نظرًا لضعف الإنبات ومشاكل أخرى في ضبط الجودة، لم تُستخدم جميع السلالات في تحليل الصفات الثلاث. في النهاية، استُخدمت بيانات 345 سلالة لتحليل استجابة الكيتين، و472 سلالة لاستجابة flg22، و456 سلالة لمقاومة TLS.ب. كوكيتم الحصول على السلالة LSLP18 من الدكتور بيرت بلوهم في جامعة أركنساس.
قياس استجابة MAMP
استُخدم نوعان مختلفان من مُحفزات الميكروبات الجزيئية (MAMPs) في هذه الدراسة: flg22 (رقم كتالوج Genscript: RP19986) والكيتين. زُرعت نباتات الذرة الرفيعة في أوعية مُدمجة موضوعة على أحواض مملوءة بالتربة (33% من مزيج Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) في الدفيئة. رُويت النباتات في اليوم السابق لجمع العينات لتجنب زيادة رطوبة الأوراق في يوم الجمع.
تم اختيار السلالات عشوائيًا، ولأسباب لوجستية، زُرعت في مجموعات من 60 سلالة. لكل سلالة، زُرعت ثلاث أوعية، بواقع بذرتين لكل سلالة. زُرعت المجموعات اللاحقة فور الانتهاء من معالجة المجموعة السابقة حتى تم تقييم جميع السلالات. أُجريت تجربتان لكل من النمطين الوراثيين، مع إعادة اختيار الأنماط الوراثية عشوائيًا في كلتا التجربتين.
أُجريت اختبارات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) كما وُصف سابقًا. باختصار، زُرعت ست بذور لكل سلالة في ثلاثة أوانٍ مختلفة. من الشتلات الناتجة، اختيرت ثلاث شتلات بناءً على تجانسها. لم تُستخدم الشتلات التي بدت غير عادية أو كانت أطول أو أقصر بشكل ملحوظ من معظم الشتلات. قُطعت أربعة أقراص ورقية بقطر 3 مم من أوسع جزء من الورقة الرابعة لثلاثة نباتات ذرة رفيعة مختلفة عمرها 15 يومًا. قرص واحد لكل ورقة من نباتين وقرصان من نبات واحد، حيث أصبح القرص الثاني هو عينة التحكم بالماء (انظر أدناه). وُضعت الأقراص بشكل فردي على 50 ميكرولتر من الماء في صفيحة سوداء ذات 96 بئرًا، وأُغلقت بغطاء ألومنيوم لتجنب تعرضها للضوء، وحُفظت في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في صباح اليوم التالي، تم تحضير محلول التفاعل باستخدام 2 ملغم/مل من كاشف التلألؤ الكيميائي L-012 (واكو، رقم الكتالوج 120-04891)، و2 ملغم/مل من بيروكسيداز الفجل (النوع VI-A، سيغما-ألدريتش، رقم الكتالوج P6782)، و100 ملغم/مل من الكيتين أو 2 ميكرومول من Flg22. أُضيف 50 ميكرولتر من محلول التفاعل هذا إلى ثلاث من الآبار الأربع. أما البئر الرابعة فكانت عينة تحكم، أُضيف إليها محلول التفاعل فقط دون إضافة MAMP. كما احتوت كل صفيحة على أربع آبار فارغة تحتوي على الماء فقط.
بعد إضافة محلول التفاعل، تم قياس الإضاءة باستخدام جهاز Synergy™ 2 متعدد الكشف لقراءة الألواح الدقيقة (BioTek) كل دقيقتين لمدة ساعة. يقوم الجهاز بقياس الإضاءة كل دقيقتين خلال هذه الساعة. تم حساب مجموع القراءات الـ 31 للحصول على قيمة كل بئر. تم حساب القيمة التقديرية لاستجابة MAMP لكل نمط جيني كالتالي: (متوسط قيمة الإضاءة في الآبار التجريبية الثلاثة - قيمة البئر الضابطة) - مطروحًا منه متوسط قيمة البئر الفارغة. كانت قيم البئر الفارغة قريبة من الصفر باستمرار.
أقراص الأوراقنيكوتيانا بنثامياناتم أيضًا تضمين سلالة واحدة من الذرة الرفيعة عالية الاستجابة (SC0003)، وسلالة واحدة من الذرة الرفيعة منخفضة الاستجابة (PI 6069) كعناصر تحكم في كل صفيحة من 96 بئرًا لأغراض مراقبة الجودة.
ب. كوكيتحضير اللقاح والتلقيح
ب. كوكيتم تحضير اللقاح كما هو موضح سابقًا. باختصار، نُقعت حبوب الذرة الرفيعة في الماء لمدة ثلاثة أيام، ثم شُطفت، ووُضعت في قوارير مخروطية سعة 1 لتر، وعُقّمت بالبخار لمدة ساعة عند ضغط 15 رطل لكل بوصة مربعة ودرجة حرارة 121 درجة مئوية. بعد ذلك، لُقّحت الحبوب بحوالي 5 مل من الميسيليوم المهروس من مزرعة طازجة منب. كوكيعُزلت سلالات LSLP18 وتُركت لمدة أسبوعين في درجة حرارة الغرفة، مع رجّ القوارير كل ثلاثة أيام. بعد أسبوعين، جُففت حبوب الذرة المصابة بالفطريات هوائيًا ثم حُفظت في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تلقيحها في الحقل. استُخدمت نفس اللقاحات طوال التجربة، وجُهزت طازجة كل عام. للتلقيح، وُضعت 6-10 حبوب مصابة في دوامة نباتات الذرة التي يتراوح عمرها بين 4 و5 أسابيع. بدأت الأبواغ الناتجة عن هذه الفطريات العدوى في نباتات الذرة الصغيرة في غضون أسبوع.
تحضير البذور
قبل زراعة بذور الذرة الرفيعة في الحقل، عُولجت بمزيج من مبيد فطري ومبيد حشري ومادة واقية، يحتوي على ما يقارب 1% من مبيد فطري سبيراتو 480 إف إس، و4% من مبيد فطري سيبرينغ 480 إف إس، و3% من مادة سوربرو 940 إي إس الواقية للبذور. ثم جُففت البذور هوائيًا لمدة ثلاثة أيام، مما أدى إلى تكوين طبقة رقيقة من هذا المزيج حولها. سمحت المادة الواقية باستخدام مبيد الأعشاب ديوال ماغنوم كمعالجة قبل الإنبات.
تقييم مقاومة بقع الأوراق المستهدفة
زُرعت نباتات الذرة الرفيعة المصابة بالمرض في محطة أبحاث المحاصيل المركزية في كلايتون، بولاية كارولاينا الشمالية، في الفترة من 14 إلى 15 يونيو 2017، وفي 20 يونيو 2018، وفق تصميم القطاعات العشوائية الكاملة، مع تكرارين تجريبيين في كل حالة. زُرعت النباتات في صفوف مفردة بطول 1.8 متر، وعرض 0.9 متر بين الصفوف، باستخدام 10 بذور لكل قطعة أرض. زُرع صفان حدوديان حول محيط كل تجربة لمنع تأثيرات الحواف. لُقّحت النباتات في 20 يوليو 2017 و20 يوليو 2018، عندما كانت في مرحلة النمو الثالثة. قُيّمت النباتات على مقياس من 1 إلى 9، حيث سُجّلت النباتات التي لا تظهر عليها أي علامات للمرض بدرجة 9، والنباتات الميتة تمامًا بدرجة 1. أُجري تقييمان في عام 2017، وأربعة تقييمات في عام 2018، بدءًا من أسبوعين بعد التلقيح في كل عام. تم حساب sAUDPC (المساحة المعيارية تحت منحنى تطور المرض) كما هو موضح سابقًا.
تاريخ النشر: 1 أبريل 2021