مكملات مبيدات الفطريات تقلل من صافي اكتساب الطاقة وتنوع الميكروبيوم في النحل البناء الانفرادي.

شكرا لكم لزيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحك (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في هذه الأثناء، ولضمان الدعم المستمر، فإننا نعرض الموقع بدون تصميم أو جافا سكريبت.
غالبًا ما تستخدم مبيدات الفطريات أثناء ازدهار ثمار الأشجار ويمكن أن تهدد الملقحات الحشرية.ومع ذلك، لا يُعرف سوى القليل عن كيفية استجابة الملقحات غير النحلية (على سبيل المثال، النحل الانفرادي، أوسميا كورنيفرون) لمبيدات الفطريات التلامسية والجهازية المستخدمة بشكل شائع على التفاح أثناء الإزهار.هذه الفجوة المعرفية تحد من القرارات التنظيمية التي تحدد التركيزات الآمنة وتوقيت رش مبيدات الفطريات.قمنا بتقييم آثار اثنين من مبيدات الفطريات الاتصال (كابتان ومانكوزب) وأربعة مبيدات الفطريات البينية / النظام النباتي (سيبروسايكلين، ميكلوبوتانيل، بيروستروبين وتريفلوكسيستروبين).التأثيرات على زيادة وزن اليرقات والبقاء على قيد الحياة ونسبة الجنس والتنوع البكتيري.تم إجراء التقييم باستخدام اختبار حيوي عن طريق الفم مزمن تمت فيه معالجة حبوب اللقاح بثلاث جرعات بناءً على الجرعة الموصى بها حاليًا للاستخدام الميداني (1X)، ونصف جرعة (0.5X) وجرعة منخفضة (0.1X).جميع جرعات المانكوزب والبيريتزولين أدت إلى انخفاض كبير في وزن الجسم وبقاء اليرقات.قمنا بعد ذلك بتسلسل الجين 16S لتوصيف بكتيريا يرقات المانكوزيب، وهو مبيد الفطريات المسؤول عن أعلى معدلات الوفيات.لقد وجدنا أن التنوع البكتيري ووفرته قد انخفض بشكل كبير في اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزيب.تشير نتائجنا المختبرية إلى أن رش بعض هذه المبيدات الفطرية أثناء التزهير يضر بشكل خاص بصحة O. cornifrons.هذه المعلومات ذات صلة بقرارات الإدارة المستقبلية المتعلقة بالاستخدام المستدام لمنتجات حماية أشجار الفاكهة وتعمل كأساس للعمليات التنظيمية التي تهدف إلى حماية الملقحات.
تم إدخال النحلة البناءة الانفرادية Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) إلى الولايات المتحدة من اليابان في أواخر السبعينيات وأوائل الثمانينيات، وقد لعبت هذه الأنواع دورًا مهمًا في التلقيح في النظم البيئية المدارة منذ ذلك الحين.تعد المجموعات المتوطنة لهذا النحل جزءًا من حوالي 50 نوعًا من النحل البري الذي يكمل النحل الذي يقوم بتلقيح بساتين اللوز والتفاح في الولايات المتحدة.يواجه النحل البناء العديد من التحديات، بما في ذلك تجزئة الموائل، ومسببات الأمراض، والمبيدات الحشرية.من بين المبيدات الحشرية، تعمل مبيدات الفطريات على تقليل اكتساب الطاقة والبحث عن الطعام وتكييف الجسم.على الرغم من أن الأبحاث الحديثة تشير إلى أن صحة النحل الماسوني تتأثر بشكل مباشر بالكائنات الحية الدقيقة المتعايشة والخارجية، 8،9 نظرًا لأن البكتيريا والفطريات يمكن أن تؤثر على التغذية والاستجابات المناعية، فإن تأثيرات التعرض لمبيدات الفطريات على التنوع الميكروبي للنحل الماسوني بدأت للتو في الظهور. درس.
يتم رش مبيدات الفطريات ذات التأثيرات المختلفة (الملامسية والجهازية) في البساتين قبل وأثناء التزهير لعلاج أمراض مثل جرب التفاح والعفن المر والعفن البني والبياض الدقيقي10،11.تعتبر مبيدات الفطريات غير ضارة للملقحات، لذلك ينصح بها البستانيون خلال فترة الإزهار؛إن تعرض النحل لمبيدات الفطريات هذه وابتلاعها أمر معروف نسبيًا، لأنه جزء من عملية تسجيل المبيدات الحشرية من قبل وكالة حماية البيئة الأمريكية والعديد من الوكالات التنظيمية الوطنية الأخرى .ومع ذلك، فإن آثار مبيدات الفطريات على غير النحل أقل شهرة لأنها غير مطلوبة بموجب اتفاقيات ترخيص التسويق في الولايات المتحدة.وبالإضافة إلى ذلك، لا توجد عموما أي بروتوكولات موحدة لاختبار النحل واحد، والحفاظ على المستعمرات التي توفر النحل للاختبار يمثل تحديا.يتم إجراء تجارب مختلفة للنحل المُدار بشكل متزايد في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية لدراسة آثار المبيدات الحشرية على النحل البري، وقد تم مؤخرًا تطوير بروتوكولات موحدة لـ O. cornifrons19.
النحل ذو القرون هو وحيدات الخلية ويستخدم تجاريا في محاصيل الكارب كمكمل أو بديل لنحل العسل.يظهر هذا النحل بين شهري مارس وأبريل، حيث يظهر الذكور مبكري النضج قبل الإناث بثلاثة إلى أربعة أيام.بعد التزاوج، تقوم الأنثى بجمع حبوب اللقاح والرحيق بشكل نشط لتوفير سلسلة من الخلايا الحاضنة داخل تجويف العش الأنبوبي (الطبيعي أو الاصطناعي)1،20.يتم وضع البيض على حبوب اللقاح داخل الخلايا.ثم تقوم الأنثى ببناء جدار من الطين قبل تحضير الخلية التالية.تكون يرقات الطور الأول محاطة بالمشيماء وتتغذى على السوائل الجنينية.من الطور الثاني إلى الخامس (ما قبل الخادرة)، تتغذى اليرقات على حبوب اللقاح.بمجرد استنفاد إمدادات حبوب اللقاح تمامًا، تشكل اليرقات شرانق، وتتشرنق وتظهر كبالغين في نفس حجرة الحضنة، عادةً في أواخر الصيف.يظهر البالغون في الربيع التالي.يرتبط بقاء البالغين على قيد الحياة بزيادة صافية في الطاقة (زيادة الوزن) بناءً على تناول الطعام.وبالتالي، فإن الجودة الغذائية لحبوب اللقاح، فضلا عن عوامل أخرى مثل الطقس أو التعرض للمبيدات الحشرية، هي العوامل المحددة للبقاء والصحة.
المبيدات الحشرية ومبيدات الفطريات المطبقة قبل الإزهار قادرة على التحرك داخل الأوعية الدموية للنبات بدرجات متفاوتة، من translaminar (على سبيل المثال، قادرة على الانتقال من السطح العلوي للأوراق إلى السطح السفلي، مثل بعض مبيدات الفطريات) 25 إلى التأثيرات الجهازية الحقيقية.، والتي يمكن أن تخترق التاج من الجذور، ويمكن أن تدخل إلى رحيق زهور التفاح، حيث يمكنها قتل O. cornifrons27 البالغ.وتتسرب بعض المبيدات الحشرية أيضًا إلى حبوب اللقاح، مما يؤثر على نمو يرقات الذرة ويتسبب في موتها.وقد أظهرت دراسات أخرى أن بعض مبيدات الفطريات يمكن أن تغير بشكل كبير سلوك التعشيش للأنواع ذات الصلة O. lignaria .بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات المختبرية والميدانية التي تحاكي سيناريوهات التعرض للمبيدات الحشرية (بما في ذلك مبيدات الفطريات) أن المبيدات الحشرية تؤثر سلبًا على وظائف الأعضاء 22 الشكل 29 وبقاء نحل العسل وبعض النحل الانفرادي.قد تؤدي رشات مبيدات الفطريات المختلفة المطبقة مباشرة على الزهور المفتوحة أثناء الإزهار إلى تلويث حبوب اللقاح التي يجمعها البالغون من أجل نمو اليرقات، والتي لا تزال آثارها قيد الدراسة.
من المعترف به بشكل متزايد أن نمو اليرقات يتأثر بحبوب اللقاح والمجتمعات الميكروبية في الجهاز الهضمي.يؤثر ميكروبيوم نحل العسل على عوامل مثل كتلة الجسم، والتغيرات الأيضية، والقابلية لمسببات الأمراض.لقد درست الدراسات السابقة تأثير مرحلة النمو والمغذيات والبيئة على ميكروبيوم النحل الانفرادي.كشفت هذه الدراسات عن أوجه تشابه في بنية ووفرة الميكروبات الحيوية لليرقات وحبوب اللقاح، بالإضافة إلى الأجناس البكتيرية الأكثر شيوعًا الزائفة والدلفتيا، بين أنواع النحل الانفرادي.ومع ذلك، على الرغم من أن مبيدات الفطريات ارتبطت باستراتيجيات لحماية صحة النحل، إلا أن آثار مبيدات الفطريات على الكائنات الحية الدقيقة في اليرقات من خلال التعرض المباشر عن طريق الفم لا تزال غير مستكشفة.
اختبرت هذه الدراسة آثار جرعات العالم الحقيقي لستة مبيدات فطريات شائعة الاستخدام مسجلة للاستخدام على ثمار الأشجار في الولايات المتحدة، بما في ذلك مبيدات الفطريات التلامسية والجهازية التي يتم تناولها عن طريق الفم ليرقات عثة دودة قرن الذرة من الأغذية الملوثة.لقد وجدنا أن مبيدات الفطريات التلامسية والجهازية قللت من زيادة وزن جسم النحل وزيادة معدل الوفيات، مع التأثيرات الأكثر خطورة المرتبطة بالمانكوزب والبيريثيوبيد.قمنا بعد ذلك بمقارنة التنوع الميكروبي لليرقات التي تتغذى على حمية حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزب مع تلك التي تتغذى على حمية المراقبة.نناقش الآليات المحتملة الكامنة وراء الوفيات والآثار المترتبة على برامج الإدارة المتكاملة للآفات والملقحات (IPPM).
تم الحصول على البالغين O. cornifrons الذين يقضيون الشتاء في الشرانق من مركز أبحاث الفاكهة، Biglerville، PA، وتم تخزينهم في درجة حرارة -3 إلى 2 درجة مئوية (±0.3 درجة مئوية).قبل التجربة (إجمالي 600 شرانق).في مايو 2022، تم نقل 100 شرانق من نوع O. cornifrons يوميًا إلى أكواب بلاستيكية (50 شرانق لكل كوب، طول DI 5 سم × 15 سم) وتم وضع مناديل داخل الأكواب لتعزيز الفتح وتوفير ركيزة قابلة للمضغ، مما يقلل الضغط على الحجر النحل37.وضع كوبين من البلاستيك تحتوي على شرانق في قفص الحشرات (30 × 30 × 30 سم، BugDorm MegaView Science Co. Ltd.، تايوان) مع 10 مل مغذيات تحتوي على محلول السكروز 50٪ وتخزينها لمدة أربعة أيام لضمان الإغلاق والتزاوج.23 درجة مئوية، الرطوبة النسبية 60%، فترة الضوء 10 لتر (كثافة منخفضة): 14 يوم.تم إطلاق 100 من الإناث والذكور المتزاوجين كل صباح لمدة ستة أيام (100 يوميًا) في عشين اصطناعيين خلال ذروة ازدهار التفاح (عش المصيدة: العرض 33.66 × الارتفاع 30.48 × الطول 46.99 سم؛ الشكل التكميلي 1).تم وضعها في مشتل ولاية بنسلفانيا، بالقرب من الكرز (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™)، والخوخ (Prunus persica 'Contender')، Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®)، والكمثرى (Pyrus perifolia 'Olympic'، Pyrus بيريفوليا 'شينكو'، بيروس بيريفوليا 'شينسيكي')، ​​شجرة تفاح كوروناريا (مالوس كوروناريا) والعديد من أنواع أشجار التفاح (مالوس كوروناريا، مالوس)، شجرة التفاح المحلية 'Co-op 30′ Enterprise™، شجرة تفاح Malus 'Co- Op 31 'Winecrisp™، بيجونيا 'Freedom'، بيجونيا 'Golden Delicious'، بيجونيا 'Nova Spy').يتناسب كل بيت طيور بلاستيكي أزرق فوق صندوقين خشبيين.يحتوي كل صندوق عش على 800 أنبوب ورق كرافت فارغ (حلزوني مفتوح، 0.8 سم معرف × 15 سم لتر) (Jonesville Paper Tube Co.، Michigan) تم إدخالها في أنابيب سيلوفان غير شفافة (0.7 OD انظر المقابس البلاستيكية (سدادات T-1X) توفر مواقع التعشيش .
كلا صندوقي العش يواجهان الشرق ومغطيان بسياج حديقة بلاستيكي أخضر (طراز Everbilt #889250EB12، حجم الفتحة 5 × 5 سم، 0.95 م × 100 م) لمنع وصول القوارض والطيور ووضعهما على سطح التربة بجوار تربة صندوق العش مربعات.صندوق العش (الشكل التكميلي 1 أ).تم جمع بيض حفار الذرة يوميًا عن طريق جمع 30 أنبوبًا من الأعشاش ونقلها إلى المختبر.باستخدام المقص، قم بعمل قطع في نهاية الأنبوب، ثم قم بتفكيك الأنبوب الحلزوني لكشف الخلايا الحاضنة.تمت إزالة البيض الفردي وحبوب اللقاح باستخدام ملعقة منحنية (مجموعة أدوات Microslide، BioQuip Products Inc.، كاليفورنيا).تم تحضين البيض على ورق ترشيح رطب ووضعه في طبق بيتري لمدة ساعتين قبل استخدامه في تجاربنا (الشكل التكميلي 1 ب - د).
في المختبر، قمنا بتقييم السمية الفموية لستة مبيدات فطريات تم تطبيقها قبل وأثناء أزهار التفاح بثلاثة تركيزات (0.1X، 0.5X، و1X، حيث 1X هي العلامة المطبقة لكل 100 جالون من الماء / فدان. الجرعة الميدانية العالية = التركيز في الحقل).، الجدول 1).تم تكرار كل تركيز 16 مرة (ن = 16).اثنين من مبيدات الفطريات الملامسة (الجدول S1: مانكوزب 2696.14 جزء في المليون والكابتان 2875.88 جزء في المليون) وأربعة مبيدات فطريات جهازية (الجدول S1: بيريثيوستروبين 250.14 جزء في المليون؛ ثلاثي فلوكسيستروبين 110.06 جزء في المليون؛ ميكلوبوتانيل أزول 75.12 جزء في المليون؛ سيبرودينيل 280.845 جزء في المليون) سمية للفواكه والخضروات محاصيل الزينة .قمنا بتجانس حبوب اللقاح باستخدام طاحونة، ونقلنا 0.20 جم إلى بئر (لوحة فالكون 24 بئرًا)، وأضفنا وخلطنا 1 ميكرولتر من محلول مبيد الفطريات لتكوين حبوب لقاح هرمية مع آبار عميقة 1 مم تم وضع البيض فيها.ضعه باستخدام ملعقة صغيرة (الشكل التكميلي 1ج،د).تم تخزين صفائح الصقر في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ورطوبة نسبية 70%.قمنا بمقارنتها مع يرقات المراقبة التي تغذت على نظام غذائي متجانس من حبوب اللقاح المعالجة بالماء النقي.سجلنا معدل الوفيات وقمنا بقياس وزن اليرقات كل يومين حتى وصلت اليرقات إلى سن ما قبل العذراء باستخدام ميزان تحليلي (Fisher Scientific، الدقة = 0.0001 جم).وأخيرا، تم تقييم نسبة الجنس عن طريق فتح الشرنقة بعد 2.5 شهرا.
تم استخراج الحمض النووي من يرقات الذرة الكاملة (ن = 3 لكل حالة معالجة، وحبوب اللقاح المعالجة وغير المعالجة بالمانكوزب) وقمنا بإجراء تحليلات للتنوع الميكروبي على هذه العينات، خاصة لأنه في المانكوزيب لوحظت أعلى نسبة وفيات في اليرقات.تلقي منزن.تم تضخيم الحمض النووي وتنقيته باستخدام مجموعة DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (Zymo Research، Irvine، CA)، وتسلسلها (600 دورة) على Illumina® MiSeq™ باستخدام مجموعة v3.تم إجراء التسلسل المستهدف لجينات الحمض النووي الريبي الريباسي 16S البكتيرية باستخدام مجموعة Quick-16S ™ NGS Library Prep Kit (Zymo Research، Irvine، CA) باستخدام الاشعال التي تستهدف منطقة V3-V4 من جين 16S rRNA.بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تسلسل 18S باستخدام تضمين PhiX بنسبة 10%، وتم إجراء التضخيم باستخدام الزوج التمهيدي 18S001 وNS4.
قم باستيراد ومعالجة القراءات المقترنة 39 باستخدام خط أنابيب QIIME2 (الإصدار 2022.11.1).تم قطع هذه القراءات ودمجها، وتمت إزالة التسلسلات الخيمرية باستخدام البرنامج المساعد DADA2 في QIIME2 (إقران الضوضاء qiime dada2) .تم تنفيذ تعيينات الفئتين 16S و18S باستخدام البرنامج المساعد لمصنف الكائنات Classify-sklearn والمصنف الأثري المُدرب مسبقًا silva-138-99-nb.
تم فحص جميع البيانات التجريبية للتحقق من الحالة الطبيعية (شابيرو ويلكس) وتجانس التباينات (اختبار ليفين).نظرًا لأن مجموعة البيانات لم تستوف افتراضات التحليل البارامتري وفشل التحويل في توحيد القيم المتبقية، فقد أجرينا ANOVA ثنائي الاتجاه (Kruskal-Wallis) مع عاملين [الوقت (ثلاث مراحل 2 و5 و8 أيام) النقاط الزمنية) ومبيدات الفطريات] لتقييم تأثير العلاج على الوزن الطازج لليرقات، ثم تم إجراء مقارنات زوجية غير معلمية بعد ذلك باستخدام اختبار ويلكوكسون.استخدمنا نموذجًا خطيًا معممًا (GLM) مع توزيع بواسون لمقارنة تأثيرات مبيدات الفطريات على البقاء عبر ثلاثة تركيزات لمبيدات الفطريات.بالنسبة لتحليل الوفرة التفاضلية، انهار عدد متغيرات تسلسل الأمبليكون (ASVs) على مستوى الجنس.تم إجراء مقارنات للوفرة التفاضلية بين المجموعات التي تستخدم 16S (مستوى الجنس) والوفرة النسبية 18S باستخدام نموذج مضاف معمم للموضع والحجم والشكل (GAMLSS) مع توزيعات عائلة بيتا المضخمة صفر (BEZI)، والتي تم تصميمها على نموذج ماكرو. .في الميكروبيوم R43 (الإصدار 1.1).1).إزالة أنواع الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء قبل التحليل التفاضلي.نظرًا للمستويات التصنيفية المختلفة لـ 18S، تم استخدام المستوى الأدنى فقط من كل تصنيف للتحليلات التفاضلية.تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام R (الإصدار 3.4.3.، مشروع CRAN) (Team 2013).
أدى التعرض للمانكوزب والبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين إلى انخفاض كبير في زيادة وزن الجسم في O. cornifrons (الشكل 1).وقد لوحظت هذه التأثيرات باستمرار لجميع الجرعات الثلاث التي تم تقييمها (الشكل 1-أ).ولم يؤثر السيكلوستروبين والميكلوبوتانيل على وزن اليرقات بشكل ملحوظ.
متوسط ​​الوزن الطازج ليرقات حفار الساق يقاس في ثلاث نقاط زمنية تحت أربع معالجات غذائية (تغذية حبوب اللقاح المتجانسة + مبيدات الفطريات: التحكم، 0.1X، 0.5X و1X جرعات).(أ) جرعة منخفضة (0.1X): نقطة المرة الأولى (اليوم 1): χ2: 30.99، DF = 6؛P <0.0001، النقطة الزمنية الثانية (اليوم 5): 22.83، DF = 0.0009؛المرة الثالثة؛النقطة (اليوم 8): χ2: 28.39، DF = 6؛(ب) نصف الجرعة (0.5X): نقطة المرة الأولى (اليوم 1): χ2: 35.67، DF = 6؛P <0.0001، النقطة الزمنية الثانية (اليوم الأول).): χ2: 15.98، مدافع = 6؛ف = 0.0090؛النقطة الزمنية الثالثة (اليوم 8) χ2: 16.47، DF = 6؛(ج) الموقع أو الجرعة الكاملة (1X): نقطة المرة الأولى (اليوم 1) χ2: 20.64، P = 6؛P = 0.0326، النقطة الزمنية الثانية (اليوم 5): χ2: 22.83، DF = 6؛ف = 0.0009؛النقطة الزمنية الثالثة (اليوم 8): χ2: 28.39، DF = 6؛التحليل اللامعلمي للتباين.تمثل الأشرطة متوسط ​​± SE للمقارنات الزوجية (α = 0.05) (n = 16) * P ≥ 0.05، ** P ≥ 0.001، *** P ≥ 0.0001.
عند أدنى جرعة (0.1X)، انخفض وزن جسم اليرقات بنسبة 60% مع ثلاثي فلوكسيستروبين، و49% مع مانكوزب، و48% مع ميكلوبوتانيل، و46% مع بيريثيستروبين (الشكل 1 أ).عند التعرض لنصف الجرعة الميدانية (0.5X)، انخفض وزن جسم يرقات المانكوزب بنسبة 86%، والبيريثيوستروبين بنسبة 52%، والتريفلوكسيستروبين بنسبة 50% (الشكل 1 ب).أدت الجرعة الميدانية الكاملة (1X) من المانكوزب إلى خفض وزن اليرقات بنسبة 82٪، والبيريثيوستروبين بنسبة 70٪، وتريفلوكسيستروبين، ومايكلوبوتانيل، والسانجارد بنسبة 30٪ تقريبًا (الشكل 1 ج).
وكان معدل الوفيات أعلى بين اليرقات التي تغذت على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزيب، يليها البيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين.زادت الوفيات مع زيادة جرعات المانكوزيب والبيريتيسولين (الشكل 2؛ الجدول 2).ومع ذلك، فإن وفيات حفار الذرة زادت بشكل طفيف فقط مع زيادة تركيزات ثلاثي فلوكسيستروبين؛لم يؤدي السيبرودينيل والكابتان إلى زيادة معدل الوفيات بشكل ملحوظ مقارنة بمعاملات السيطرة.
وتمت مقارنة معدل وفيات يرقات الذبابة الحفارة بعد تناول حبوب اللقاح المعالجة بشكل فردي بستة مبيدات فطرية مختلفة.كان المانكوزيب والبنتوبيراميد أكثر حساسية للتعرض عن طريق الفم لديدان الذرة (GLM: χ = 29.45، DF = 20، P = 0.0059) (الخط، المنحدر = 0.29، P <0.001؛ المنحدر = 0.24، P <0.00)).
في المتوسط، في جميع العلاجات، كان 39.05% من المرضى من الإناث و60.95% من الذكور.ومن بين علاجات المراقبة، كانت نسبة النساء 40% في كل من دراسات الجرعة المنخفضة (0.1X) ونصف الجرعة (0.5X)، و30% في دراسات الجرعة الميدانية (1X).عند جرعة 0.1X، من بين اليرقات التي تغذت على حبوب اللقاح والمعالجة بالمانكوزيب والميكلوبوتانيل، كان 33.33% من البالغين إناثًا، و22% من اليرقات البالغة إناثًا، و44% من اليرقات البالغة إناثًا، و44% من اليرقات البالغة إناثًا.أنثى، 41٪ من اليرقات البالغة كانت من الإناث، وكانت الضوابط 31٪ (الشكل 3 أ).عند 0.5 مرة من الجرعة، كانت 33% من الديدان البالغة في مجموعة المانكوزيب والبيريثيوستروبين من الإناث، و36% في مجموعة التريفلوكسيستروبين، و41% في مجموعة الميكلوبوتانيل، و46% في مجموعة السيبروستروبين.وكان هذا الرقم 53٪ في المجموعة.في مجموعة الكابتن و 38٪ في المجموعة الضابطة (الشكل 3 ب).عند جرعة 1X، كان 30% من مجموعة المانكوزب من النساء، و36% من مجموعة البيريثيوستروبين، و44% من مجموعة ثلاثي فلوكسيستروبين، و38% من مجموعة الميكلوبوتانيل، و50% من مجموعة المراقبة من النساء - 38.5% (الشكل 3 ج). .
النسبة المئوية للحفارين من الإناث والذكور بعد التعرض لمبيد الفطريات في مرحلة اليرقات.(أ) جرعة منخفضة (0.1X).(ب) نصف الجرعة (0.5X).(ج) الجرعة الميدانية أو الجرعة الكاملة (1X).
أظهر تحليل تسلسل 16S أن المجموعة البكتيرية تختلف بين اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزيب واليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح غير المعالجة (الشكل 4 أ).كان المؤشر الميكروبي لليرقات غير المعالجة التي تتغذى على حبوب اللقاح أعلى من مؤشر اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزيب (الشكل 4 ب).على الرغم من أن الفرق الملحوظ في الثراء بين المجموعات لم يكن ذا دلالة إحصائية، إلا أنه كان أقل بكثير من ذلك الذي لوحظ بالنسبة لليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح غير المعالجة (الشكل 4 ج).أظهرت الوفرة النسبية أن الكائنات الحية الدقيقة في اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح كانت أكثر تنوعًا من تلك الموجودة في اليرقات التي تتغذى على اليرقات المعالجة بالمانكوزب (الشكل 5 أ).كشف التحليل الوصفي عن وجود 28 جنسًا في العينات الضابطة والعينات المعالجة بالمانكوزيب (الشكل 5 ب).ج كشف التحليل باستخدام تسلسل 18S عن عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية (الشكل التكميلي 2).
وتمت مقارنة ملفات تعريف SAV المستندة إلى تسلسل 16S مع ثراء شانون والثراء الملحوظ على مستوى اللجوء.( أ ) تحليل الإحداثيات الرئيسي (PCoA) استنادًا إلى البنية العامة للمجتمع الميكروبي في اليرقات غير المعالجة التي تتغذى على حبوب اللقاح أو التحكم (الأزرق) واليرقات التي تتغذى على المانكوزيب (البرتقالي).تمثل كل نقطة بيانات عينة منفصلة.تم حساب PCoA باستخدام مسافة Bray-Curtis لتوزيع t متعدد المتغيرات.تمثل الأشكال البيضاوية مستوى الثقة 80%.( ب ) Boxplot وبيانات ثروة شانون الخام (النقاط) و ج .الثروة الملحوظة.تعرض Boxplots مربعات للخط المتوسط ​​والمدى الربعي (IQR) و1.5 × IQR (n = 3).
تكوين المجتمعات الميكروبية لليرقات المغذية على حبوب اللقاح المعالجة وغير المعالجة بالمانكوزيب.( أ ) تقرأ الوفرة النسبية للأجناس الميكروبية في اليرقات.( ب ) خريطة الحرارة للمجتمعات الميكروبية المحددة.الدلفتيا (نسبة الأرجحية (OR) = 0.67، P = 0.0030) والزائفة (OR = 0.3، P = 0.0074)، البكتيريا الدقيقة (OR = 0.75، P = 0.0617) (OR = 1.5، P = 0.0060)؛يتم تجميع صفوف الخريطة الحرارية باستخدام مسافة الارتباط ومتوسط ​​الاتصال.
تظهر نتائجنا أن التعرض عن طريق الفم لمبيدات الفطريات التلامسية (المانكوزب) والجهازية (البيروستروبين والتريفلوكسيستروبين)، والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع أثناء الإزهار، قلل بشكل كبير من زيادة الوزن وزيادة معدل وفيات يرقات الذرة.بالإضافة إلى ذلك، قلل المانكوزب بشكل كبير من تنوع وثراء الميكروبيوم خلال مرحلة ما قبل العذراء.أدى الميكلوبوتانيل، وهو مبيد فطريات جهازي آخر، إلى تقليل زيادة وزن جسم اليرقات بشكل ملحوظ في جميع الجرعات الثلاث.وكان هذا التأثير واضحا في النقطتين الزمنيتين الثانية (اليوم 5) والثالثة (اليوم 8).في المقابل، لم يقلل السيبرودينيل والكابتان بشكل ملحوظ من زيادة الوزن أو البقاء على قيد الحياة مقارنة بالمجموعة الضابطة.على حد علمنا، هذا العمل هو الأول الذي يحدد آثار المعدلات الميدانية لمبيدات الفطريات المختلفة المستخدمة لحماية محاصيل الذرة من خلال التعرض المباشر لحبوب اللقاح.
جميع معاملات مبيدات الفطريات أدت إلى انخفاض ملحوظ في زيادة وزن الجسم مقارنة بمعاملات السيطرة.كان للمانكوزيب التأثير الأكبر على زيادة وزن جسم اليرقات بمتوسط ​​انخفاض قدره 51%، يليه البيريثيوستروبين.ومع ذلك، لم تبلغ دراسات أخرى عن الآثار الضارة للجرعات الميدانية من مبيدات الفطريات على مراحل اليرقات.على الرغم من أنه ثبت أن المبيدات الحيوية ثنائية الثيوكرباميت لها سمية حادة منخفضة، إلا أن ثنائي إيثيل كربامات الإيثيلين (EBDCS) مثل المانكوزب يمكن أن يتحلل إلى كبريتيد إيثيلين اليوريا.ونظرًا لتأثيراته المطفرة في الحيوانات الأخرى، فقد يكون منتج التحلل هذا مسؤولاً عن التأثيرات المرصودة .أظهرت الدراسات السابقة أن تكوين ثيوريا الإيثيلين يتأثر بعوامل مثل ارتفاع درجة الحرارة ومستويات الرطوبة وطول فترة تخزين المنتج .يمكن لظروف التخزين المناسبة للمبيدات الحيوية أن تخفف من هذه الآثار الجانبية.بالإضافة إلى ذلك، أعربت هيئة سلامة الأغذية الأوروبية عن قلقها بشأن سمية البيريثيوبيد، الذي ثبت أنه مسرطن للجهاز الهضمي للحيوانات الأخرى.
يؤدي تناول المانكوزيب والبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين عن طريق الفم إلى زيادة معدل وفيات يرقات حفار الذرة.في المقابل، لم يكن للميكلوبوتانيل والسيبروسايكلين والكابتان أي تأثير على معدل الوفيات.تختلف هذه النتائج عن نتائج Ladurner et al.52، الذين أظهروا أن الكابتن قلل بشكل كبير من بقاء البالغ O. lignaria وApis mellifera L. (Hymenoptera، Apisidae).بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على مبيدات الفطريات مثل الكابتان والبوسكاليد تسبب وفيات اليرقات أو تغير سلوك التغذية.هذه التغييرات، بدورها، يمكن أن تؤثر على الجودة الغذائية لحبوب اللقاح وفي نهاية المطاف على اكتساب الطاقة في مرحلة اليرقات.وكانت الوفيات التي لوحظت في المجموعة الضابطة متسقة مع دراسات أخرى (56،57).
يمكن تفسير نسبة الجنس المفضلة للذكور التي لوحظت في عملنا بعوامل مثل عدم كفاية التزاوج وسوء الأحوال الجوية أثناء الإزهار، كما اقترح سابقًا بالنسبة لـ O. cornuta بواسطة Vicens وBosch.على الرغم من أن الإناث والذكور في دراستنا لديهم أربعة أيام للتزاوج (وهي فترة تعتبر بشكل عام كافية للتزاوج الناجح)، فقد تعمدنا تقليل شدة الضوء لتقليل التوتر.ومع ذلك، قد يتداخل هذا التعديل عن غير قصد مع عملية التزاوج.بالإضافة إلى ذلك، يتعرض النحل لعدة أيام من الأحوال الجوية السيئة، بما في ذلك المطر ودرجات الحرارة المنخفضة (<5 درجة مئوية)، والتي يمكن أن تؤثر أيضًا سلبًا على نجاح التزاوج.
على الرغم من أن دراستنا ركزت على ميكروبيوم اليرقات بأكمله، إلا أن نتائجنا توفر نظرة ثاقبة للعلاقات المحتملة بين المجتمعات البكتيرية التي قد تكون حاسمة لتغذية النحل والتعرض لمبيدات الفطريات.على سبيل المثال، أدت اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزب إلى انخفاض كبير في بنية المجتمع الميكروبي ووفرته مقارنة باليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح غير المعالجة.في اليرقات التي تستهلك حبوب اللقاح غير المعالجة، كانت المجموعات البكتيرية Proteobacteria و Actinobacteria هي المهيمنة وكانت في الغالب هوائية أو هوائية اختيارية.من المعروف أن بكتيريا دلفت، المرتبطة عادة بأنواع النحل الانفرادي، لها نشاط مضاد حيوي، مما يشير إلى دور وقائي محتمل ضد مسببات الأمراض.وهناك نوع آخر من البكتيريا، وهو الزائفة، كان موجودًا بكثرة في اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح غير المعالجة، ولكن انخفض بشكل ملحوظ في اليرقات المعالجة بالمانكوزب.تدعم نتائجنا الدراسات السابقة التي حددت الزائفة باعتبارها واحدة من أكثر الأجناس وفرة في O. bicornis35 وغيرها من الدبابير الانفرادية34.على الرغم من عدم دراسة الأدلة التجريبية لدور الزائفة في صحة O. cornifrons، فقد ثبت أن هذه البكتيريا تعزز تخليق السموم الواقية في خنفساء Paederus fuscipes وتعزز استقلاب الأرجينين في المختبر 35، 65. تشير هذه الملاحظات دور محتمل في الدفاع الفيروسي والبكتيري خلال فترة تطور يرقات O. cornifrons.Microbacterium هو جنس آخر تم تحديده في دراستنا والذي يُقال أنه موجود بأعداد كبيرة في يرقات ذبابة الجندي الأسود في ظل ظروف المجاعة .في يرقات O. cornifrons، قد تساهم البكتيريا الدقيقة في توازن ومرونة ميكروبيوم الأمعاء في ظل ظروف الضغط.بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على رودوكوكوس في يرقات O. cornifrons وهو معروف بقدراته على إزالة السموم.تم العثور على هذا الجنس أيضًا في أمعاء A. florea، ولكن بكميات منخفضة جدًا68.تظهر نتائجنا وجود اختلافات وراثية متعددة عبر العديد من الأصناف الميكروبية التي يمكن أن تغير عمليات التمثيل الغذائي في اليرقات.ومع ذلك، هناك حاجة إلى فهم أفضل للتنوع الوظيفي لO. cornifrons.
باختصار، تشير النتائج إلى أن المانكوزيب والبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين قلل من زيادة وزن الجسم وزيادة معدل وفيات يرقات حفار الذرة.على الرغم من وجود قلق متزايد بشأن آثار مبيدات الفطريات على الملقحات، هناك حاجة إلى فهم أفضل لتأثيرات المستقلبات المتبقية لهذه المركبات.ويمكن دمج هذه النتائج في التوصيات الخاصة ببرامج الإدارة المتكاملة للملقحات التي تساعد المزارعين على تجنب استخدام مبيدات فطريات معينة قبل وأثناء إزهار أشجار الفاكهة عن طريق اختيار مبيدات الفطريات وتغيير توقيت الاستخدام، أو عن طريق تشجيع استخدام بدائل أقل ضررًا 36. هذه المعلومات مهم لتطوير التوصيات.بشأن استخدام المبيدات الحشرية، مثل تعديل برامج الرش الحالية وتغيير توقيت الرش عند اختيار مبيدات الفطريات أو الترويج لاستخدام البدائل الأقل خطورة.هناك حاجة إلى مزيد من البحث في الآثار الضارة لمبيدات الفطريات على نسبة الجنس، وسلوك التغذية، وميكروبيوم الأمعاء، والآليات الجزيئية الكامنة وراء فقدان الوزن والوفيات لحفار الذرة.
تم إيداع بيانات المصدر 1 و2 و3 في الأشكال 1 و2 في مستودع بياناتFigshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 وhttps://doi.org/10.6084/m9.فيجشير.24996233.التسلسلات التي تم تحليلها في الدراسة الحالية (الشكلان 4 و 5) متاحة في مستودع NCBI SRA تحت رقم الانضمام PRJNA1023565.
Bosch، J. and Kemp، WP تطوير وإنشاء أنواع نحل العسل كملقحات للمحاصيل الزراعية: مثال جنس Osmia.(غشائيات الأجنحة: Megachilidae) وأشجار الفاكهة.ثور.نطومور.الموارد.92، 3–16 (2002).
باركر، ملغ وآخرون.ممارسات التلقيح وتصورات الملقحات البديلة بين مزارعي التفاح في نيويورك وبنسلفانيا.تحديث.زراعة.النظم الغذائية.35، 1-14 (2020).
Koch I., Lonsdorf EW, Artz DR, Pitts-Singer TL و Ricketts TH علم البيئة واقتصاديات تلقيح اللوز باستخدام النحل المحلي.ي. الاقتصاد.نطومور.111، 16-25 (2018).
لي، إي.، هو، واي.، وبارك، واي.-إل.آثار تغير المناخ على فينولوجيا تراجوبان: الآثار المترتبة على إدارة السكان.تسلق.التغيير 150، 305-317 (2018).
Artz، DR و Pitts-Singer، TL تأثير مبيدات الفطريات والبخاخات المساعدة على سلوك التعشيش لنحلين انفراديين مُدارين (Osmia lignaria و Megachile rotundata).بلوس وان 10، e0135688 (2015).
بوفيه، S. وآخرون.يتداخل مبيد فطريات المحاصيل منخفض السمية (فينبوكونازول) مع إشارات الجودة الإنجابية للذكور مما يؤدي إلى انخفاض نجاح التزاوج في النحل الانفرادي البري.تطبيقات.علم البيئة.59، 1596–1607 (2022).
سجولاسترا ف. وآخرون.المبيدات الحشرية النيونيكوتينويدية والتخليق الحيوي للإرغوستيرول تمنع وفيات مبيدات الفطريات التآزرية في ثلاثة أنواع من النحل.مكافحة الآفات.العلم.73، 1236-1243 (2017).
كوهنيمان جي جي، جيلونج جي، فان دايك إم تي، فوردايس آر إف.ويرقات الدبابير الانفرادية Danforth BN تغير التنوع البكتيري الذي توفره حبوب اللقاح لنحل التعشيش الجذعية Osmia cornifrons (Megachilidae).أمام.الكائنات الحية الدقيقة.13، 1057626 (2023).
Dharampal PS، Danforth BN وSteffan SA الكائنات الحية الدقيقة التكافلية الخارجية في حبوب اللقاح المخمرة لها نفس أهمية تطوير النحل الانفرادي مثل حبوب اللقاح نفسها.علم البيئة.تطور.12.e8788 (2022).
Kelderer M، Manici LM، Caputo F and Thalheimer M. الزراعة بين الصفوف في بساتين التفاح للسيطرة على أمراض إعادة البذر: دراسة فعالية عملية تعتمد على المؤشرات الميكروبية.التربة النباتية 357، 381-393 (2012).
Martin PL، Kravchik T.، Khodadadi F.، Achimovich SG وPeter KA العفن المر للتفاح في وسط المحيط الأطلسي بالولايات المتحدة: تقييم الأنواع المسببة وتأثير الظروف الجوية الإقليمية وقابلية الصنف.علم أمراض النبات 111، 966-981 (2021).
كولين إم جي، طومسون إل جي، كارولان جي كيه، ستاوت جي كيه.وستانلي DA مبيدات الفطريات ومبيدات الأعشاب والنحل: مراجعة منهجية للأبحاث والأساليب الحالية.بلوس وان 14، e0225743 (2019).
Pilling، ED و Jepson، PC التأثيرات التآزرية لمبيدات الفطريات EBI ومبيدات الحشرات البيرثرويدية على نحل العسل (Apis mellifera).آفات العلم.39، 293-297 (1993).
Mussen، EC، Lopez، JE and Peng، CY تأثير مبيدات الفطريات المختارة على نمو وتطور يرقات نحل العسل Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae).الأربعاء.نطومور.33، 1151-1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D., and McArt, S. دليل اتخاذ القرار لاستخدام المبيدات الحشرية لحماية الملقحات في بساتين الأشجار (جامعة كورنيل، 2018).
Iwasaki، JM and Hogendoorn، K. تعرض النحل للمبيدات غير الحشرية: مراجعة للطرق والنتائج المبلغ عنها.زراعة.النظام البيئي.الأربعاء.314، 107423 (2021).
كوبيت آم، كلينجر إي، كوكس فوستر دل، راميريز را.و Pitts-Singer TL تأثير نوع العرض والتعرض للمبيدات الحشرية على تطور يرقات Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae).الأربعاء.نطومور.51، 240-251 (2022).
Kopit AM وPitts-Singer TL مسارات التعرض لمبيدات الآفات لنحل العش الفارغ الانفرادي.الأربعاء.نطومور.47، 499-510 (2018).
عموم، NT وآخرون.بروتوكول اختبار حيوي جديد للابتلاع لتقييم سمية مبيدات الآفات في نحل الحدائق الياباني البالغ (Osmia cornifrons).العلم.التقارير 10، 9517 (2020).