يؤدي استخدام مبيدات الفطريات إلى تقليل صافي الطاقة المكتسبة وتنوع الميكروبيوم في نحل البناء الانفرادي.

نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحكم (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون تنسيق أو جافا سكريبت.
تُستخدم مبيدات الفطريات بكثرة خلال فترة إزهار أشجار الفاكهة، وقد تُشكل خطرًا على الحشرات الملقحة. مع ذلك، لا تزال المعلومات شحيحة حول كيفية استجابة الملقحات غير النحل (مثل النحل الانفرادي، Osmia cornifrons) لمبيدات الفطريات الملامسة والجهازية الشائعة الاستخدام على التفاح خلال فترة الإزهار. هذه الفجوة المعرفية تُعيق القرارات التنظيمية المتعلقة بتحديد التركيزات الآمنة وتوقيت رش مبيدات الفطريات. قمنا بتقييم تأثيرات نوعين من مبيدات الفطريات الملامسة (كابتان ومانكوزيب) وأربعة أنواع من مبيدات الفطريات التي تُصيب الطبقات النباتية/النظام النباتي (سيبروسيكلين، ميكلوبوتانيل، بيروستروبين، وتريفلوكسيستروبين). شملت الدراسة تأثيرات هذه المبيدات على زيادة وزن اليرقات، ومعدل بقائها، ونسبة الجنس، والتنوع البكتيري. أُجري التقييم باستخدام اختبار حيوي فموي مزمن، حيث عُولجت حبوب اللقاح بثلاث جرعات بناءً على الجرعة الموصى بها حاليًا للاستخدام الميداني (جرعة كاملة)، ونصف الجرعة (0.5 جرعة)، وجرعة منخفضة (0.1 جرعة). أدت جميع جرعات مانكوزيب وبيريتيسولين إلى انخفاض ملحوظ في وزن الجسم ومعدل بقاء اليرقات. ثم قمنا بتسلسل جين 16S لتوصيف البكتيريا الموجودة في يرقات ذبابة الفاكهة (O. cornifrons) المعالجة بالمانكوزيب، وهو مبيد فطري مسؤول عن أعلى معدلات النفوق. ووجدنا أن التنوع البكتيري ووفرة البكتيريا قد انخفضا بشكل ملحوظ في اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة بالمانكوزيب. تشير نتائج مختبرنا إلى أن رش بعض هذه المبيدات الفطرية خلال فترة الإزهار ضار بشكل خاص بصحة ذبابة الفاكهة (O. cornifrons). هذه المعلومات مهمة لاتخاذ قرارات إدارية مستقبلية بشأن الاستخدام المستدام لمنتجات حماية أشجار الفاكهة، وتُشكل أساسًا للعمليات التنظيمية التي تهدف إلى حماية الملقحات.
تم إدخال نحل البناء الانفرادي Osmia cornifrons (رتبة غشائيات الأجنحة: فصيلة النحل البنّاء) إلى الولايات المتحدة من اليابان في أواخر سبعينيات وأوائل ثمانينيات القرن الماضي، ومنذ ذلك الحين، لعب هذا النوع دورًا هامًا في تلقيح النظم البيئية المُدارة. تُعدّ مجموعات هذا النحل المُتأقلمة جزءًا من حوالي 50 نوعًا من النحل البري التي تُكمّل النحل الذي يُلقّح بساتين اللوز والتفاح في الولايات المتحدة.^2،3 يواجه نحل البناء العديد من التحديات، بما في ذلك تجزئة الموائل، ومسببات الأمراض، والمبيدات الحشرية.^3،4 ومن بين المبيدات الحشرية، تُقلّل مبيدات الفطريات من اكتساب الطاقة، والبحث عن الغذاء،⁵ وحالة الجسم.^6،7 على الرغم من أن الأبحاث الحديثة تُشير إلى أن صحة نحل البناء تتأثر بشكل مباشر بالكائنات الحية الدقيقة المُتعايشة وغير المُتعايشة،^8،9 نظرًا لأن البكتيريا والفطريات يُمكن أن تُؤثر على التغذية والاستجابات المناعية، إلا أن آثار التعرّض لمبيدات الفطريات على التنوع الميكروبي لنحل البناء لا تزال قيد الدراسة.
تُستخدم مبيدات الفطريات ذات التأثيرات المختلفة (الملامسة والجهازية) في البساتين قبل وأثناء الإزهار لعلاج أمراض مثل جرب التفاح، والعفن المر، والعفن البني، والبياض الدقيقي.^10،11 وتُعتبر مبيدات الفطريات غير ضارة بالملقحات، لذا يُنصح بها البستانيون خلال فترة الإزهار. ويُعرف تعرض النحل لهذه المبيدات وابتلاعها بشكل جيد نسبيًا، حيث يُعد ذلك جزءًا من عملية تسجيل المبيدات لدى وكالة حماية البيئة الأمريكية والعديد من الهيئات التنظيمية الوطنية الأخرى.^12،13،14 ومع ذلك، فإن تأثيرات مبيدات الفطريات على الكائنات غير النحلية أقل وضوحًا لأنها غير مطلوبة بموجب اتفاقيات ترخيص التسويق في الولايات المتحدة.¹⁵ إضافةً إلى ذلك، لا توجد عمومًا بروتوكولات موحدة لاختبار النحل الفردي،^16،17 كما أن الحفاظ على خلايا النحل التي توفر النحل للاختبار يُعد أمرًا صعبًا.¹⁸ تُجرى تجارب على أنواع مختلفة من النحل المُدار بشكل متزايد في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية لدراسة آثار المبيدات على النحل البري، وقد تم تطوير بروتوكولات موحدة مؤخرًا لـ O. cornifrons19.
النحل ذو القرون هو نوع من النحل أحادي الخلية، ويُستخدم تجاريًا في مزارع الكارب كمكمل أو بديل لنحل العسل. يظهر هذا النحل بين شهري مارس وأبريل، حيث يظهر الذكور قبل الإناث بثلاثة إلى أربعة أيام. بعد التزاوج، تقوم الأنثى بجمع حبوب اللقاح والرحيق بنشاط لتوفير سلسلة من خلايا الحضانة داخل تجويف العش الأنبوبي (طبيعي أو اصطناعي)^1،20. تضع الأنثى البيض على حبوب اللقاح داخل الخلايا، ثم تبني جدارًا طينيًا قبل تجهيز الخلية التالية. تتغذى يرقات الطور الأول، المحاطة بغشاء الكوريون، على السوائل الجنينية. من الطور الثاني إلى الخامس (مرحلة ما قبل العذراء)، تتغذى اليرقات على حبوب اللقاح²². بمجرد نفاد مخزون حبوب اللقاح تمامًا، تُشكل اليرقات شرانق، وتتحول إلى عذارى، ثم تخرج كنحل بالغ في نفس حجرة الحضانة، عادةً في أواخر الصيف^20،23. يظهر النحل البالغ في الربيع التالي. يرتبط بقاء النحل البالغ بزيادة صافي الطاقة (زيادة الوزن) بناءً على كمية الغذاء المتناولة. وبالتالي، فإن الجودة الغذائية لحبوب اللقاح، بالإضافة إلى عوامل أخرى مثل الطقس أو التعرض للمبيدات الحشرية، هي عوامل محددة للبقاء والصحة 24.
تستطيع المبيدات الحشرية والفطرية المستخدمة قبل الإزهار الانتقال داخل الأوعية النباتية بدرجات متفاوتة، من الانتقال عبر الصفائح (مثل الانتقال من السطح العلوي للأوراق إلى السطح السفلي، كما هو الحال مع بعض المبيدات الفطرية)²⁵ إلى التأثيرات الجهازية الحقيقية. ويمكن لبعض المبيدات، التي تخترق تاج النبات من الجذور، أن تدخل رحيق أزهار التفاح²⁶، حيث يمكنها قتل حشرات O. cornifrons البالغة²⁷. كما تتسرب بعض المبيدات إلى حبوب اللقاح، مما يؤثر على نمو يرقات الذرة ويؤدي إلى موتها¹⁹. وقد أظهرت دراسات أخرى أن بعض المبيدات الفطرية يمكن أن تُغير بشكل كبير سلوك التعشيش لدى النوع ذي الصلة O. lignaria²⁸. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات المخبرية والميدانية التي تحاكي سيناريوهات التعرض للمبيدات (بما في ذلك المبيدات الفطرية) أن المبيدات تؤثر سلبًا على فسيولوجيا²² وشكل²⁹ وبقاء نحل العسل وبعض أنواع النحل الانفرادي. قد تؤدي أنواع مختلفة من البخاخات المبيدة للفطريات التي يتم رشها مباشرة على الأزهار المتفتحة أثناء الإزهار إلى تلوث حبوب اللقاح التي يجمعها البالغون لتطور اليرقات، ولا تزال آثار ذلك قيد الدراسة 30.
يتزايد الإدراك بأن نمو اليرقات يتأثر بحبوب اللقاح والمجتمعات الميكروبية في الجهاز الهضمي. يؤثر ميكروبيوم نحل العسل على عوامل مثل كتلة الجسم³¹، والتغيرات الأيضية²²، وقابلية الإصابة بالأمراض³². وقد تناولت دراسات سابقة تأثير مرحلة النمو، والمغذيات، والبيئة على ميكروبيوم النحل الانفرادي. وكشفت هذه الدراسات عن أوجه تشابه في بنية ووفرة ميكروبيومات اليرقات وحبوب اللقاح³³، بالإضافة إلى أكثر أجناس البكتيريا شيوعًا، الزائفة والديلفتيا، بين أنواع النحل الانفرادي. ومع ذلك، ورغم ارتباط مبيدات الفطريات باستراتيجيات حماية صحة النحل، فإن تأثيرات هذه المبيدات على ميكروبات اليرقات من خلال التعرض الفموي المباشر لا تزال غير مدروسة.
اختبرت هذه الدراسة تأثيرات جرعات واقعية من ستة مبيدات فطرية شائعة الاستخدام ومسجلة للاستخدام على أشجار الفاكهة في الولايات المتحدة، بما في ذلك مبيدات فطرية ملامسة وجهازية تُعطى عن طريق الفم ليرقات عثة دودة الذرة من غذاء ملوث. ووجدنا أن المبيدات الفطرية الملامسة والجهازية تُقلل من زيادة وزن النحل وتزيد من معدل نفوقه، مع ارتباط أشد التأثيرات بمادتي المانكوزيب والبيريثيوبيد. ثم قارنا التنوع الميكروبي لليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة بالمانكوزيب مع تلك التي تغذت على النظام الغذائي الضابط. ونناقش الآليات المحتملة الكامنة وراء النفوق وآثارها على برامج الإدارة المتكاملة للآفات والملقحات (IPPM)³⁶.
تم الحصول على نحل O. cornifrons البالغ، الذي يقضي فصل الشتاء داخل شرانقه، من مركز أبحاث الفاكهة في بيغلرفيل، بنسلفانيا، وحُفظ في درجة حرارة تتراوح بين -3 و2 درجة مئوية (±0.3 درجة مئوية). قبل التجربة (600 شرنقة إجمالاً). في مايو 2022، نُقلت 100 شرنقة من O. cornifrons يوميًا إلى أكواب بلاستيكية (50 شرنقة لكل كوب، قطر الكوب 5 سم × طوله 15 سم)، ووُضعت مناديل مبللة داخل الأكواب لتسهيل فتح الشرانق وتوفير ركيزة قابلة للمضغ، مما يقلل من إجهاد النحل. وُضع كوبان بلاستيكيان يحتويان على شرانق في قفص حشرات (30 × 30 × 30 سم، شركة BugDorm MegaView Science المحدودة، تايوان) مع مغذيات سعة 10 مل تحتوي على محلول سكروز بنسبة 50%، وحُفظت لمدة أربعة أيام لضمان إغلاق الشرانق والتزاوج. 23 درجة مئوية، رطوبة نسبية 60%، فترة إضاءة 10 ساعات (شدة منخفضة): 14 يومًا. تم إطلاق 100 أنثى وذكر متزاوج كل صباح لمدة ستة أيام (100 في اليوم) في عشين اصطناعيين خلال ذروة إزهار التفاح (عش المصيدة: العرض 33.66 × الارتفاع 30.48 × الطول 46.99 سم؛ الشكل التكميلي 1). وُضِعَتْ في مشتل ولاية بنسلفانيا، بالقرب من أشجار الكرز (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™)، والخوخ (Prunus persica 'Contender')، والخوخ (Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®)، والإجاص (Pyrus perifolia 'Olympic'، وPyrus perifolia 'Shinko'، وPyrus perifolia 'Shinseiki')، وشجرة التفاح التاجي (Malus coronaria)، والعديد من أنواع أشجار التفاح (Malus coronaria، وMalus)، وشجرة التفاح المحلية 'Co-op 30' Enterprise™، وشجرة التفاح 'Co-Op 31' Winecrisp™، والبيجونيا 'Freedom'، والبيجونيا 'Golden Delicious'، والبيجونيا 'Nova Spy'. يُوضع كل بيت طيور بلاستيكي أزرق فوق صندوقين خشبيين. يحتوي كل صندوق تعشيش على 800 أنبوب ورق كرافت فارغ (مفتوح حلزونيًا، 0.8 سم قطر داخلي × 15 سم طول) (شركة جونزفيل لأنابيب الورق، ميشيغان) يتم إدخالها في أنابيب السيلوفان المعتمة (0.7 قطر خارجي انظر السدادات البلاستيكية (سدادات T-1X) توفر مواقع التعشيش.
كانت صناديق التعشيش مواجهة للشرق ومغطاة بسياج بلاستيكي أخضر (طراز Everbilt رقم 889250EB12، مقاس الفتحة 5 × 5 سم، 0.95 م × 100 م) لمنع وصول القوارض والطيور، ووُضعت على سطح التربة بجوار صناديق التربة الخاصة بصناديق التعشيش. (انظر الشكل التكميلي 1أ). جُمعت بيوض حفار الذرة يوميًا عن طريق جمع 30 أنبوبًا من الأعشاش ونقلها إلى المختبر. باستخدام مقص، قُطع طرف الأنبوب، ثم فُكّك الأنبوب الحلزوني لكشف خلايا الحضانة. أُزيلت البيوض الفردية وحبوب اللقاح باستخدام ملعقة منحنية (مجموعة أدوات Microslide، شركة BioQuip Products Inc.، كاليفورنيا). حُضنت البيوض على ورق ترشيح رطب ووُضعت في طبق بتري لمدة ساعتين قبل استخدامها في تجاربنا (انظر الأشكال التكميلية 1ب-د).
في المختبر، قمنا بتقييم السمية الفموية لستة مبيدات فطرية تم تطبيقها قبل وأثناء فترة إزهار التفاح بثلاثة تراكيز (0.1X، 0.5X، و1X، حيث يمثل 1X الكمية المستخدمة لكل 100 جالون من الماء/فدان. الجرعة الحقلية العالية = التركيز في الحقل). (انظر الجدول 1). تم تكرار كل تركيز 16 مرة (n = 16). تم تقييم سمية مبيدين فطريين ملامسين (الجدول S1: مانكوزيب 2696.14 جزء في المليون وكابتان 2875.88 جزء في المليون) وأربعة مبيدات فطرية جهازية (الجدول S1: بيريثيوستروبين 250.14 جزء في المليون؛ تريفلوكسيستروبين 110.06 جزء في المليون؛ ميكلوبوتانيل أزول 75.12 جزء في المليون؛ سيبرودينيل 280.845 جزء في المليون) على الفواكه والخضراوات ونباتات الزينة. قمنا بتجانس حبوب اللقاح باستخدام مطحنة، ثم نقلنا 0.20 غرام إلى إحدى حفر صفيحة فالكون (24 حفرة)، وأضفنا 1 ميكرولتر من محلول مبيد الفطريات وخلطناه جيدًا لتكوين حبوب لقاح هرمية الشكل مع حفر بعمق 1 مم، حيث وُضعت البيوض باستخدام ملعقة صغيرة (الشكل التكميلي 1ج، د). حُفظت صفائح فالكون في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ورطوبة نسبية 70%. قارنّا هذه البيوض بيرقات ضابطة تغذت على نظام غذائي متجانس من حبوب اللقاح مُعالج بالماء النقي. سجلنا معدل النفوق وقمنا بقياس وزن اليرقات يومًا بعد يوم حتى بلغت اليرقات مرحلة ما قبل التعذر باستخدام ميزان تحليلي (فيشر ساينتيفيك، دقة = 0.0001 غرام). أخيرًا، تم تقييم نسبة الجنس بفتح الشرنقة بعد شهرين ونصف.
تم استخلاص الحمض النووي من يرقات O. cornifrons الكاملة (عددها 3 لكل حالة معالجة، حبوب لقاح معالجة بالمانكوزيب وأخرى غير معالجة)، وأجرينا تحليلات للتنوع الميكروبي على هذه العينات، خاصةً أن أعلى معدل وفيات لوحظ في اليرقات التي تلقت المانكوزيب. تم تضخيم الحمض النووي وتنقيته باستخدام مجموعة DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (شركة Zymo Research، إرفاين، كاليفورنيا)، ثم تم تسلسله (600 دورة) على جهاز Illumina® MiSeq™ باستخدام مجموعة v3. أُجري التسلسل المستهدف لجينات الحمض النووي الريبوزي 16S البكتيرية باستخدام مجموعة Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (شركة Zymo Research، إرفاين، كاليفورنيا) باستخدام بادئات تستهدف منطقة V3-V4 من جين الحمض النووي الريبوزي 16S. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تسلسل 18S باستخدام 10٪ من تضمين PhiX، وتم إجراء التضخيم باستخدام زوج البادئات 18S001 و NS4.
تم استيراد ومعالجة القراءات المزدوجة باستخدام برنامج QIIME2 (الإصدار 2022.11.1). ثم جرى تقليم هذه القراءات ودمجها، وإزالة التسلسلات الهجينة باستخدام إضافة DADA2 في QIIME2 (qiime dada2 noise pairing). وتم تحديد فئات 16S و18S باستخدام إضافة مصنف الكائنات Classify-sklearn ونموذج silva-138-99-nb-classifier المدرب مسبقًا.
تم فحص جميع البيانات التجريبية للتأكد من توزيعها الطبيعي (اختبار شابيرو-ويلكس) وتجانس تبايناتها (اختبار ليفين). ولأن مجموعة البيانات لم تستوفِ افتراضات التحليل البارامتري، ولأن التحويل لم ينجح في توحيد البواقي، أجرينا تحليل تباين ثنائي الاتجاه غير بارامتري (كروسكال-واليس) بعاملين [الزمن (ثلاث نقاط زمنية: 2، 5، و8 أيام) ومبيد الفطريات] لتقييم تأثير المعالجة على الوزن الطازج لليرقات، ثم أجرينا مقارنات ثنائية غير بارامترية لاحقة باستخدام اختبار ويلكوكسون. استخدمنا نموذجًا خطيًا معمّمًا (GLM) بتوزيع بواسون لمقارنة تأثيرات مبيدات الفطريات على البقاء عبر ثلاثة تراكيز مختلفة من مبيدات الفطريات. ولتحليل الوفرة التفاضلية، تم تجميع عدد متغيرات تسلسل الأمبليكون (ASVs) على مستوى الجنس. أُجريت مقارنات للوفرة التفاضلية بين المجموعات باستخدام وفرة 16S (على مستوى الجنس) و18S النسبية، وذلك باستخدام نموذج إضافي مُعمم للموقع والمقياس والشكل (GAMLSS) مع توزيعات عائلة بيتا ذات التضخم الصفري (BEZI)، والتي تم نمذجتها باستخدام ماكرو في برنامج Microbiome R43 (الإصدار 1.1). 1) تم استبعاد أنواع الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء قبل إجراء التحليل التفاضلي. نظرًا لاختلاف المستويات التصنيفية لـ 18S، تم استخدام المستوى الأدنى فقط من كل تصنيف في التحليلات التفاضلية. أُجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج R (الإصدار 3.4.3، مشروع CRAN) (فريق 2013).
أدى التعرض للمانكوزيب والبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين إلى انخفاض ملحوظ في زيادة وزن الجسم لدى حشرة O. cornifrons (الشكل 1). وقد لوحظت هذه التأثيرات باستمرار مع جميع الجرعات الثلاث التي تم تقييمها (الشكل 1أ-ج). أما السيكلوستروبين والميكلوبوتانيل فلم يُحدثا انخفاضًا ملحوظًا في وزن اليرقات.
متوسط ​​الوزن الطازج ليرقات حفار الساق، مُقاسًا في ثلاث نقاط زمنية ضمن أربع معاملات غذائية (تغذية متجانسة بحبوب اللقاح + مبيد فطري: المجموعة الضابطة، جرعات 0.1X، 0.5X، و1X). (أ) الجرعة المنخفضة (0.1X): النقطة الزمنية الأولى (اليوم 1): χ²: 30.99، درجة الحرية = 6؛ P < 0.0001، النقطة الزمنية الثانية (اليوم 5): 22.83، درجة الحرية = 0.0009؛ النقطة الزمنية الثالثة (اليوم 8): χ²: 28.39، درجة الحرية = 6؛ (ب) نصف الجرعة (0.5X): النقطة الزمنية الأولى (اليوم 1): χ²: 35.67، درجة الحرية = 6؛ P < 0.0001، النقطة الزمنية الثانية (اليوم 1): χ²: 15.98، درجة الحرية = 6؛ P = 0.0090؛ النقطة الزمنية الثالثة (اليوم 8): χ²: 16.47، درجة الحرية = 6؛ (ج) الموقع أو الجرعة الكاملة (1X): النقطة الزمنية الأولى (اليوم 1): χ²: 20.64، P = 6؛ P = 0.0326، النقطة الزمنية الثانية (اليوم 5): χ²: 22.83، درجة الحرية = 6؛ P = 0.0009؛ النقطة الزمنية الثالثة (اليوم 8): χ²: 28.39، درجة الحرية = 6؛ تحليل التباين غير البارامتري. تمثل الأعمدة المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمقارنات الزوجية (α = 0.05) (n = 16) *P ≤ 0.05، **P ≤ 0.001، ***P ≤ 0.0001.
عند أدنى جرعة (0.1X)، انخفض وزن يرقات الحشرات بنسبة 60% مع التريفلوكسيستروبين، و49% مع المانكوزيب، و48% مع الميكلوبوتانيل، و46% مع البيريثيوستروبين (الشكل 1أ). وعند تعريضها لنصف الجرعة الميدانية (0.5X)، انخفض وزن يرقات المانكوزيب بنسبة 86%، والبيريثيوستروبين بنسبة 52%، والتريفلوكسيستروبين بنسبة 50% (الشكل 1ب). أما الجرعة الميدانية الكاملة (1X) من المانكوزيب فقد خفضت وزن اليرقات بنسبة 82%، والبيريثيوستروبين بنسبة 70%، والتريفلوكسيستروبين والميكلوبوتانيل والسانجارد بنسبة 30% تقريبًا (الشكل 1ج).
كانت نسبة النفوق أعلى ما يمكن بين اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة بالمانكوزيب، تليها اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة بالبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين. وازدادت نسبة النفوق مع زيادة جرعات المانكوزيب والبيريتيسولين (الشكل 2؛ الجدول 2). ومع ذلك، لم يزد معدل نفوق حفار الذرة إلا قليلاً مع زيادة تركيزات التريفلوكسيستروبين؛ ولم يُحدث السيبرودينيل والكابتان زيادة ملحوظة في معدل النفوق مقارنةً بالمعاملات الضابطة.
تمت مقارنة معدل وفيات يرقات ذبابة حفار الذرة بعد تناولها حبوب لقاح مُعالجة بشكل فردي بستة مبيدات فطرية مختلفة. كان المانكوزيب والبنتوبيراميد أكثر حساسية للتعرض الفموي ليرقات ذبابة الذرة (GLM: χ² = 29.45، DF = 20، P = 0.0059) (الخط، الميل = 0.29، P < 0.001؛ الميل = 0.24، P < 0.00).
في المتوسط، بلغت نسبة الإناث بين المرضى في جميع العلاجات 39.05%، بينما بلغت نسبة الذكور 60.95%. أما في العلاجات الضابطة، فكانت نسبة النساء 40% في كلتا الدراستين اللتين تناولتا جرعة منخفضة (0.1X) ونصف جرعة (0.5X)، و30% في الدراسات التي تناولت جرعة كاملة (1X). عند جرعة 0.1X، كانت نسبة الإناث بين اليرقات التي تغذت على حبوب اللقاح والمعالجة بالمانكوزيب والميكلوبوتانيل 33.33% من البالغات، و22% من البالغات، و44% من اليرقات البالغة، و41% من اليرقات البالغة، بينما بلغت النسبة في المجموعة الضابطة 31% (الشكل 3أ). عند جرعة نصف الجرعة المرجعية، كانت نسبة الإناث من الديدان البالغة 33% في مجموعة المانكوزيب والبيريثيوستروبين، و36% في مجموعة التريفلوكسيستروبين، و41% في مجموعة الميكلوبوتانيل، و46% في مجموعة السيبروستروبين. وبلغت هذه النسبة 53% في مجموعة الكابتان، و38% في المجموعة الضابطة (الشكل 3ب). أما عند جرعة الجرعة المرجعية، فكانت نسبة الإناث 30% في مجموعة المانكوزيب، و36% في مجموعة البيريثيوستروبين، و44% في مجموعة التريفلوكسيستروبين، و38% في مجموعة الميكلوبوتانيل، و50% في المجموعة الضابطة (الشكل 3ج).
نسبة إناث وذكور حفارات الأشجار بعد تعرض اليرقات لمبيد الفطريات. (أ) جرعة منخفضة (0.1X). ​​(ب) نصف جرعة (0.5X). (ج) جرعة حقلية أو جرعة كاملة (1X).
أظهر تحليل تسلسل 16S اختلافًا في المجموعة البكتيرية بين اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة بالمانكوزيب واليرقات التي تغذت على حبوب لقاح غير معالجة (الشكل 4أ). وكان المؤشر الميكروبي لليرقات غير المعالجة التي تغذت على حبوب اللقاح أعلى من نظيره في اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة بالمانكوزيب (الشكل 4ب). وعلى الرغم من أن الفرق الملحوظ في التنوع بين المجموعتين لم يكن ذا دلالة إحصائية، إلا أنه كان أقل بشكل ملحوظ من ذلك الذي لوحظ في اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح غير معالجة (الشكل 4ج). وأظهرت الوفرة النسبية أن الميكروبات في اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح غير معالجة كانت أكثر تنوعًا من تلك الموجودة في اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة بالمانكوزيب (الشكل 5أ). وكشف التحليل الوصفي عن وجود 28 جنسًا في عينات التحكم والعينات المعالجة بالمانكوزيب (الشكل 5ب). ولم يُظهر التحليل باستخدام تسلسل 18S أي اختلافات ذات دلالة إحصائية (الشكل التكميلي 2).
تمت مقارنة خصائص SAV المستندة إلى تسلسلات 16S مع ثراء شانون والثراء الملحوظ على مستوى الشعبة. (أ) تحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA) بناءً على بنية المجتمع الميكروبي الكلية في اليرقات غير المعالجة التي تغذت على حبوب اللقاح أو المجموعة الضابطة (باللون الأزرق) واليرقات التي تغذت على المانكوزيب (باللون البرتقالي). تمثل كل نقطة بيانات عينة منفصلة. تم حساب PCoA باستخدام مسافة براي-كورتيس لتوزيع t متعدد المتغيرات. تمثل الأشكال البيضاوية مستوى الثقة 80%. (ب) مخطط الصندوق، بيانات ثراء شانون الخام (نقاط) و(ج) الثراء الملحوظ. تُظهر مخططات الصندوق مربعات لخط الوسيط، والمدى الربيعي (IQR)، و1.5 × IQR (n = 3).
تكوين المجتمعات الميكروبية في اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح معالجة وغير معالجة بالمانكوزيب. (أ) الوفرة النسبية لقراءات الأجناس الميكروبية في اليرقات. (ب) خريطة حرارية للمجتمعات الميكروبية المحددة. ديلفتيا (نسبة الأرجحية = 0.67، قيمة P = 0.0030) وبسودوموناس (نسبة الأرجحية = 0.3، قيمة P = 0.0074)، ميكروبكتيريوم (نسبة الأرجحية = 0.75، قيمة P = 0.0617) (نسبة الأرجحية = 1.5، قيمة P = 0.0060)؛ تم تجميع صفوف الخريطة الحرارية باستخدام مسافة الارتباط ومتوسط ​​الاتصال.
تُظهر نتائجنا أن التعرض الفموي لمبيدات الفطريات الملامسة (مانكوزيب) والجهازية (بيروستروبين وتريفلوكسيستروبين)، والتي تُستخدم على نطاق واسع خلال فترة الإزهار، يُقلل بشكل ملحوظ من زيادة وزن يرقات الذرة ويزيد من معدل نفوقها. بالإضافة إلى ذلك، قلل المانكوزيب بشكل ملحوظ من تنوع وغنى الميكروبيوم خلال مرحلة ما قبل التعذر. كما قلل الميكلوبوتانيل، وهو مبيد فطريات جهازي آخر، بشكل ملحوظ من زيادة وزن اليرقات عند جميع الجرعات الثلاث. وكان هذا التأثير واضحًا في النقطتين الزمنيتين الثانية (اليوم الخامس) والثالثة (اليوم الثامن). في المقابل، لم يُقلل السيبرودينيل والكابتان بشكل ملحوظ من زيادة الوزن أو معدل البقاء على قيد الحياة مقارنةً بمجموعة التحكم. وحسب علمنا، تُعد هذه الدراسة الأولى التي تُحدد تأثيرات معدلات الاستخدام الميداني لمبيدات الفطريات المختلفة المستخدمة لحماية محاصيل الذرة من خلال التعرض المباشر لحبوب اللقاح.
أدت جميع معالجات مبيدات الفطريات إلى انخفاض ملحوظ في زيادة وزن الجسم مقارنةً بالمعالجات الضابطة. وكان للمنكوزيب التأثير الأكبر على زيادة وزن اليرقات بمتوسط ​​انخفاض قدره 51%، يليه البيريثيوستروبين. مع ذلك، لم تُبلغ دراسات أخرى عن أي آثار ضارة للجرعات الميدانية من مبيدات الفطريات على مراحل اليرقات⁴⁴. على الرغم من أن مبيدات ثنائي ثيوكاربامات الحيوية أظهرت سمية حادة منخفضة⁴⁵، إلا أن ثنائي ثيوكاربامات الإيثيلين (EBDCS) مثل المنكوزيب يمكن أن يتحلل إلى كبريتيد إيثيلين اليوريا. ونظرًا لتأثيراته المطفرة في حيوانات أخرى، فقد يكون ناتج التحلل هذا مسؤولاً عن الآثار الملحوظة^46،47. وقد أظهرت دراسات سابقة أن تكوين ثيوريا الإيثيلين يتأثر بعوامل مثل ارتفاع درجة الحرارة⁴⁸، ومستويات الرطوبة⁴⁹، ومدة تخزين المنتج⁵⁰. ويمكن لظروف التخزين المناسبة للمبيدات الحيوية أن تُخفف من هذه الآثار الجانبية. بالإضافة إلى ذلك، أعربت الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية عن قلقها بشأن سمية البيريثيوبيد، الذي ثبت أنه مادة مسرطنة للجهاز الهضمي للحيوانات الأخرى 51.
يؤدي تناول المانكوزيب والبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين عن طريق الفم إلى زيادة معدل وفيات يرقات حفار الذرة. في المقابل، لم يكن للميكلوبوتانيل والسيبروسيكلين والكابتان أي تأثير على معدل الوفيات. وتختلف هذه النتائج عن نتائج لادورنر وآخرون⁵²، الذين أظهروا أن الكابتان يقلل بشكل ملحوظ من بقاء نحل العسل البالغ (O. lignaria) ونحل العسل الأوروبي (Apis mellifera L.) (رتبة غشائيات الأجنحة، فصيلة النحل). بالإضافة إلى ذلك، وُجد أن مبيدات الفطريات مثل الكابتان والبوسكاليد تسبب وفيات اليرقات^52،53،54 أو تغير سلوكها الغذائي⁵⁵. هذه التغيرات، بدورها، يمكن أن تؤثر على القيمة الغذائية لحبوب اللقاح، وبالتالي على الطاقة التي تكتسبها اليرقات. وكانت نسبة الوفيات الملاحظة في المجموعة الضابطة متوافقة مع دراسات أخرى^56،57.
قد يُعزى تفوق نسبة الذكور الملحوظ في دراستنا إلى عوامل مثل قلة التزاوج وسوء الأحوال الجوية خلال فترة الإزهار، كما أشار فيسينس وبوش سابقًا في دراسة أجريت على نحل O. cornuta. ورغم أن الإناث والذكور في دراستنا أُتيحت لهم أربعة أيام للتزاوج (وهي فترة تُعتبر كافية عمومًا للتزاوج الناجح)، فقد حرصنا على تقليل شدة الإضاءة لتقليل الإجهاد. مع ذلك، قد يُؤثر هذا التعديل سلبًا على عملية التزاوج⁶¹. إضافةً إلى ذلك، تتعرض النحلات لعدة أيام من الطقس السيئ، بما في ذلك الأمطار وانخفاض درجات الحرارة (أقل من 5 درجات مئوية)، مما قد يُؤثر سلبًا على نجاح التزاوج^4،23.
على الرغم من أن دراستنا ركزت على الميكروبيوم الكامل لليرقات، إلا أن نتائجنا تُسلط الضوء على العلاقات المحتملة بين المجتمعات البكتيرية التي قد تكون حاسمة لتغذية النحل والتعرض لمبيدات الفطريات. فعلى سبيل المثال، أظهرت اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح مُعالجة بالمانكوزيب انخفاضًا ملحوظًا في بنية ووفرة المجتمع الميكروبي مقارنةً باليرقات التي تغذت على حبوب لقاح غير مُعالجة. وفي اليرقات التي تناولت حبوب لقاح غير مُعالجة، سادت مجموعتا البكتيريا Proteobacteria وActinobacteria، وكانتا هوائيتين في الغالب أو هوائيتين اختياريتين. ومن المعروف أن بكتيريا ديلفت، المرتبطة عادةً بأنواع النحل الانفرادي، تمتلك نشاطًا مضادًا حيويًا، مما يشير إلى دور وقائي محتمل ضد مسببات الأمراض. كما كان نوع آخر من البكتيريا، وهو Pseudomonas، وفيرًا في اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح غير مُعالجة، ولكنه انخفض بشكل ملحوظ في اليرقات المُعالجة بالمانكوزيب. وتدعم نتائجنا الدراسات السابقة التي حددت Pseudomonas كواحد من أكثر الأجناس وفرةً في O. bicornis35 وأنواع أخرى من الدبابير الانفرادية34. على الرغم من عدم وجود دراسات تجريبية حول دور بكتيريا الزائفة (Pseudomonas) في صحة يرقات ذبابة الجندي الأسود (O. cornifrons)، فقد ثبت أن هذه البكتيريا تعزز تخليق السموم الواقية في خنفساء Paederus fuscipes، كما تعزز استقلاب الأرجينين في المختبر^{35، 65}. تشير هذه الملاحظات إلى دور محتمل لها في الدفاع ضد الفيروسات والبكتيريا خلال فترة نمو يرقات O. cornifrons. تُعد بكتيريا الميكروبكتيريوم (Microbacterium) جنسًا آخر تم تحديده في دراستنا، وقد وُجدت بأعداد كبيرة في يرقات ذبابة الجندي الأسود في ظروف المجاعة⁶⁶. في يرقات O. cornifrons، قد تُساهم الميكروبكتيريوم في توازن ومرونة الميكروبيوم المعوي في ظل ظروف الإجهاد. بالإضافة إلى ذلك، وُجدت بكتيريا الرودوكوكوس (Rhodococcus) في يرقات O. cornifrons، وهي معروفة بقدرتها على إزالة السموم⁶⁷. يوجد هذا الجنس أيضًا في أمعاء ذبابة A. florea، ولكن بوفرة منخفضة جدًا⁶⁸. تُظهر نتائجنا وجود اختلافات جينية متعددة عبر العديد من التصنيفات الميكروبية التي يمكن أن تُغير العمليات الأيضية في اليرقات. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة إلى فهم أفضل للتنوع الوظيفي لـ O. cornifrons.
باختصار، تشير النتائج إلى أن المانكوزيب والبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين قللت من زيادة وزن يرقات حفار الذرة وزادت من معدل نفوقها. ورغم تزايد المخاوف بشأن تأثير مبيدات الفطريات على الملقحات، إلا أن هناك حاجة لفهم أفضل لتأثيرات نواتج الأيض المتبقية لهذه المركبات. ويمكن دمج هذه النتائج في توصيات برامج الإدارة المتكاملة للملقحات، والتي تساعد المزارعين على تجنب استخدام بعض مبيدات الفطريات قبل وأثناء إزهار أشجار الفاكهة، وذلك عن طريق اختيار مبيدات الفطريات المناسبة وتغيير توقيت رشها، أو عن طريق تشجيع استخدام بدائل أقل ضررًا. وتُعد هذه المعلومات مهمة لوضع توصيات بشأن استخدام المبيدات، مثل تعديل برامج الرش الحالية وتغيير توقيت الرش عند اختيار مبيدات الفطريات، أو تشجيع استخدام بدائل أقل خطورة. كما يلزم إجراء المزيد من البحوث حول الآثار الضارة لمبيدات الفطريات على نسبة الجنس، وسلوك التغذية، والميكروبيوم المعوي، والآليات الجزيئية الكامنة وراء فقدان وزن حفار الذرة ومعدل نفوقه.
تم إيداع بيانات المصدر 1 و2 و3 في الشكلين 1 و2 في مستودع بيانات figshare، المعرف الرقمي للكائن (DOI): https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 و https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. أما التسلسلات التي تم تحليلها في هذه الدراسة (الشكلان 4 و5) فهي متاحة في مستودع NCBI SRA تحت رقم الوصول PRJNA1023565.
بوش، ج. وكيمب، دبليو بي. تطوير وتأسيس أنواع نحل العسل كملقحات للمحاصيل الزراعية: مثال جنس أوسميا. (غشائيات الأجنحة: ميغاشيليداي) وأشجار الفاكهة. نشرة الموارد الطبيعية. 92، 3-16 (2002).
باركر، إم جي وآخرون. ممارسات التلقيح وتصورات الملقحات البديلة بين مزارعي التفاح في نيويورك وبنسلفانيا. تحديث. الزراعة. النظم الغذائية. 35، 1-14 (2020).
كوخ آي، لونسدورف إي دبليو، آرتز دي آر، بيتس-سينجر تي إل وريكتس تي إتش. علم البيئة والاقتصاد لتلقيح اللوز باستخدام النحل المحلي. مجلة الاقتصاد. 111، 16-25 (2018).
لي، إي.، هي، واي.، وبارك، واي.-إل. تأثيرات تغير المناخ على دورة حياة التراجوبان: الآثار المترتبة على إدارة السكان. تغير المناخ 150، 305-317 (2018).
آرتز، دي آر وبيتس-سينجر، تي إل. تأثير رش المبيدات الفطرية والمواد المساعدة على سلوك التعشيش لدى نوعين من النحل الانفرادي المُدار (Osmia lignaria وMegachile rotundata). مجلة PLoS One، المجلد 10، e0135688 (2015).
بوفيه، إس. وآخرون. مبيد فطري منخفض السمية للمحاصيل (فينبوكونازول) يتداخل مع إشارات جودة التكاثر الذكرية مما يؤدي إلى انخفاض نجاح التزاوج في النحل البري الانفرادي. مجلة علم البيئة التطبيقية. 59، 1596-1607 (2022).
Sgolastra F. et al. مبيدات النيونيكوتينويد الحشرية وتخليق الإرغوستيرول يثبطان معدل وفيات مبيدات الفطريات التآزرية في ثلاثة أنواع من النحل. مكافحة الآفات. العلم. 73، 1236-1243 (2017).
كونمان جي جي، جيلونج جي، فان دايك إم تي، فوردايس آر إف، ودانفورث بي إن. يرقات الدبابير الانفرادية تُغير التنوع البكتيري الذي يوفره حبوب اللقاح لنحل أوسميا كورنيفرونز (ميغاشيليداي) الذي يبني أعشاشه على السيقان. فرونت. ميكروأورغانيزم. 13، 1057626 (2023).
دارامبال، بي إس، دانفورث، بي إن، وستيفان، إس إيه. الكائنات الدقيقة التكافلية الخارجية في حبوب اللقاح المخمرة لا تقل أهمية عن حبوب اللقاح نفسها في نمو النحل الانفرادي. علم البيئة. التطور. 12. e8788 (2022).
كيلدرير إم، مانيسي إل إم، كابوتو إف، وثالهايمر إم. زراعة ما بين الصفوف في بساتين التفاح للسيطرة على أمراض إعادة البذر: دراسة فعالية عملية تستند إلى المؤشرات الميكروبية. التربة النباتية 357، 381-393 (2012).
مارتن بي إل، كرافتشيك تي، خودادادي إف، أشيموفيتش إس جي، وبيتر كيه إيه. العفن المر للتفاح في منطقة وسط المحيط الأطلسي بالولايات المتحدة: تقييم الأنواع المسببة وتأثير الظروف المناخية الإقليمية وقابلية الأصناف للإصابة. علم أمراض النبات 111، 966-981 (2021).
كولين إم جي، طومسون إل جيه، كارولان جيه كيه، ستاوت جيه كيه، وستانلي دي إيه. مبيدات الفطريات ومبيدات الأعشاب والنحل: مراجعة منهجية للأبحاث والأساليب الحالية. PLoS One 14، e0225743 (2019).
بيلينغ، إي دي وجيبسون، بي سي. التأثيرات التآزرية لمبيدات الفطريات EBI ومبيدات الحشرات البيريثرويدية على نحل العسل (Apis mellifera). الآفات: العلم. 39، 293-297 (1993).
موسن، إي سي، لوبيز، جيه إي، وبينغ، سي واي. تأثير مبيدات فطرية مختارة على نمو وتطور يرقات نحل العسل Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). الأربعاء. نتومور. 33، 1151-1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D., and McArt, S. Decision Guide for the Besticide Use to Protect Polinators in Tree Orchards (Cornell University, 2018).
إيواساكي، جيه إم وهوغندورن، ك. تعريض النحل لمبيدات غير حشرية: مراجعة للطرق والنتائج المبلغ عنها. الزراعة. النظام البيئي. الأربعاء. 314، 107423 (2021).
كوبيت إيه إم، كلينجر إي، كوكس-فوستر دي إل، راميريز آر إيه، وبيتس-سينجر تي إل. تأثير نوع الإمداد والتعرض للمبيدات على نمو يرقات أوسميا ليجناريا (غشائيات الأجنحة: ميغاشيليداي). الأربعاء. نتومور. 51، 240-251 (2022).
كوبيت إيه إم وبيتس-سينجر تي إل. مسارات تعرض النحل المنفرد الذي فرغت أعشاشه للمبيدات الحشرية. الأربعاء. نتومور. 47، 499-510 (2018).
بان، إن تي وآخرون. بروتوكول جديد للفحص البيولوجي عن طريق الابتلاع لتقييم سمية المبيدات في نحل الحدائق الياباني البالغ (Osmia cornifrons). تقارير العلوم 10، 9517 (2020).