تؤدي مكملات مبيدات الفطريات إلى تقليل اكتساب الطاقة الصافية وتنوع الميكروبيوم في النحل الماسوني الانفرادي.

شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحك (أو تعطيل وضع التوافق في متصفح Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون تنسيق أو جافا سكريبت.
تُستخدم مبيدات الفطريات بكثرة خلال فترة إزهار ثمار الأشجار، وقد تُهدد الحشرات المُلقحة. ومع ذلك، لا يُعرف الكثير عن كيفية استجابة المُلقحات غير النحلية (مثل النحل الانفرادي، أوسميا كورنيفرون) لمبيدات الفطريات التلامسية والجهازية المُستخدمة عادةً على التفاح خلال فترة الإزهار. تُحدّ هذه الفجوة المعرفية من القرارات التنظيمية التي تُحدد التركيزات الآمنة وتوقيت رش مبيدات الفطريات. قيّمنا آثار مُبيدين فطريين تلامسيين (الكابتان والمانكوزيب) وأربعة مُبيدات فطرية بينية/نظامية (سيبروسيكلين، ميكلوبوتانيل، بايروستروبين، وتريفلوكسستروبين). دُرست الآثار على زيادة وزن اليرقات، وبقائها، ونسبة الجنس، والتنوع البكتيري. أُجري التقييم باستخدام اختبار حيوي فموي مُزمن، حيث عولجت حبوب اللقاح بثلاث جرعات بناءً على الجرعة المُوصى بها حاليًا للاستخدام الحقلي (جرعة واحدة)، ونصف جرعة (0.5 جرعة)، وجرعة منخفضة (0.1 جرعة). أدت جميع جرعات المانكوزيب والبيريتيسولين إلى انخفاض كبير في وزن الجسم وبقاء اليرقات. قمنا بعد ذلك بتسلسل جين 16S لتوصيف بكتيريا يرقات المانكوزيب، وهو مبيد الفطريات المسؤول عن أعلى معدل وفيات. وجدنا أن تنوع البكتيريا ووفرتها انخفضا بشكل ملحوظ في اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزيب. تشير نتائجنا المخبرية إلى أن رش بعض هذه المبيدات الفطرية أثناء الإزهار يضر بشكل خاص بصحة شجرة القيقب. تُعد هذه المعلومات ذات أهمية لقرارات الإدارة المستقبلية المتعلقة بالاستخدام المستدام لمنتجات حماية أشجار الفاكهة، وتُشكل أساسًا للإجراءات التنظيمية الرامية إلى حماية الملقحات.
أُدخل نحل البناء الانفرادي Osmia cornifrons (غشائيات الأجنحة: Megachilidae) إلى الولايات المتحدة من اليابان في أواخر سبعينيات وأوائل ثمانينيات القرن الماضي، ولعب هذا النوع دورًا هامًا في التلقيح في النظم البيئية المُدارة منذ ذلك الحين. تُشكل التجمعات المُستوطنة لهذا النحل جزءًا من حوالي 50 نوعًا من النحل البري الذي يُكمل النحل الذي يُلقح بساتين اللوز والتفاح في الولايات المتحدة2،3. يواجه نحل البناء العديد من التحديات، بما في ذلك تجزئة الموائل، ومسببات الأمراض، والمبيدات الحشرية3،4. من بين المبيدات الحشرية، تُقلل مبيدات الفطريات من اكتساب الطاقة، والبحث عن الطعام5، وتكييف الجسم6،7. على الرغم من أن الأبحاث الحديثة تُشير إلى أن صحة نحل البناء تتأثر بشكل مباشر بالكائنات الحية الدقيقة المُتعايشة والخارجية،8،9 لأن البكتيريا والفطريات يُمكن أن تؤثر على التغذية والاستجابات المناعية، إلا أن آثار التعرض لمبيدات الفطريات على التنوع الميكروبي لنحل البناء بدأت للتو.
تُرش مبيدات الفطريات ذات التأثيرات المختلفة (الملامسة والجهازية) في البساتين قبل الإزهار وأثناءه لعلاج أمراض مثل جرب التفاح، والعفن المر، والعفن البني، والبياض الدقيقي. 10،11. تُعتبر مبيدات الفطريات غير ضارة بالملقحات، لذا يُنصح بها للبستانيين خلال فترة الإزهار؛ ويُعدّ تعرض النحل لهذه المبيدات وابتلاعها أمرًا معروفًا نسبيًا، إذ يُعدّ جزءًا من عملية تسجيل المبيدات لدى وكالة حماية البيئة الأمريكية والعديد من الهيئات التنظيمية الوطنية الأخرى. 12،13،14. ومع ذلك، فإن آثار مبيدات الفطريات على غير النحل أقل شهرة نظرًا لعدم اشتراطها بموجب اتفاقيات ترخيص التسويق في الولايات المتحدة. 15. بالإضافة إلى ذلك، لا توجد عمومًا بروتوكولات موحدة لاختبار النحل المنفرد. 16،17، كما أن الحفاظ على المستعمرات التي تُوفر النحل للاختبار أمرٌ صعب. 18. يتم إجراء تجارب على أنواع مختلفة من النحل بشكل متزايد في أوروبا والولايات المتحدة لدراسة آثار المبيدات الحشرية على النحل البري، وقد تم مؤخرًا تطوير بروتوكولات موحدة لـ O. cornifrons19.
النحل ذو القرون هو من فصيلة الوحيدات، ويُستخدم تجاريًا في محاصيل الكارب كمكمل أو بديل لنحل العسل. يخرج هذا النحل بين شهري مارس وأبريل، حيث يخرج الذكور المبكرون قبل الإناث بثلاثة إلى أربعة أيام. بعد التزاوج، تجمع الأنثى حبوب اللقاح والرحيق بنشاط لتوفير سلسلة من خلايا الحضنة داخل تجويف العش الأنبوبي (طبيعي أو صناعي)1،20. توضع البيض على حبوب اللقاح داخل الخلايا؛ ثم تبني الأنثى جدارًا طينيًا قبل تجهيز الخلية التالية. تُحاط يرقات الطور الأول بالغشاء المشيمي وتتغذى على السوائل الجنينية. من الطور الثاني إلى الطور الخامس (مرحلة ما قبل العذراء)، تتغذى اليرقات على حبوب اللقاح22. بمجرد استنفاد مخزون حبوب اللقاح تمامًا، تُشكل اليرقات شرانق، ثم تتحول إلى خادرة، وتخرج كطور بالغ في حجرة الحضنة نفسها، عادةً في أواخر الصيف20،23. يخرج البالغون في الربيع التالي. يرتبط بقاء البالغين بزيادة الطاقة الصافية (زيادة الوزن) بناءً على كمية الطعام المتناولة. وهكذا، فإن الجودة الغذائية لحبوب اللقاح، فضلاً عن عوامل أخرى مثل الطقس أو التعرض للمبيدات الحشرية، هي عوامل تحدد البقاء والصحة24.
يمكن للمبيدات الحشرية ومبيدات الفطريات المُستخدمة قبل الإزهار أن تنتقل داخل الأوعية الدموية النباتية بدرجات متفاوتة، بدءًا من انتقالها عبر الصفائح (مثلًا، من السطح العلوي للأوراق إلى السطح السفلي، كما هو الحال في بعض مبيدات الفطريات) 25 وصولًا إلى تأثيرات جهازية فعلية. يمكن لمبيدات الفطريات، التي يمكنها اختراق تاج الزهرة من الجذور، أن تدخل رحيق أزهار التفاح 26، حيث يمكنها قتل حشرات الذرة البالغة O. cornifrons 27. كما تتسرب بعض المبيدات إلى حبوب اللقاح، مما يؤثر على نمو يرقات الذرة ويتسبب في موتها 19. وقد أظهرت دراسات أخرى أن بعض مبيدات الفطريات يمكن أن تُغير بشكل كبير سلوك تعشيش الأنواع ذات الصلة O. lignaria 28. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات المختبرية والميدانية التي تُحاكي سيناريوهات التعرض للمبيدات (بما في ذلك مبيدات الفطريات) أن المبيدات تؤثر سلبًا على فسيولوجيا 22 ومورفولوجيا 29 وبقاء نحل العسل وبعض النحل الانفرادي. قد تؤدي الرشات الفطرية المختلفة التي يتم تطبيقها مباشرة على الزهور المفتوحة أثناء الإزهار إلى تلويث حبوب اللقاح التي يجمعها البالغون لنمو اليرقات، ولا تزال آثارها بحاجة إلى دراسة30.
يتزايد الإدراك بأن نمو اليرقات يتأثر بحبوب اللقاح والمجموعات الميكروبية في الجهاز الهضمي. يؤثر ميكروبيوم نحل العسل على معايير مثل كتلة الجسم31، والتغيرات الأيضية22، وقابلية الإصابة بمسببات الأمراض32. وقد بحثت دراسات سابقة في تأثير مرحلة النمو، والعناصر الغذائية، والبيئة على ميكروبيوم النحل الانفرادي. وكشفت هذه الدراسات عن أوجه تشابه في بنية ووفرة ميكروبيوم اليرقات وحبوب اللقاح33، بالإضافة إلى أكثر أجناس البكتيريا شيوعًا، الزائفة الزنجارية (Pseudomonas) والدلفي (Delftia)، بين أنواع النحل الانفرادي. ومع ذلك، على الرغم من ارتباط مبيدات الفطريات باستراتيجيات لحماية صحة النحل، إلا أن آثار مبيدات الفطريات على ميكروبيوم اليرقات من خلال التعرض الفموي المباشر لا تزال غير مستكشفة.
اختبرت هذه الدراسة آثار جرعات واقعية من ستة مبيدات فطرية شائعة الاستخدام ومسجلة للاستخدام على ثمار الأشجار في الولايات المتحدة، بما في ذلك مبيدات فطرية جهازية وملامسة تُعطى عن طريق الفم ليرقات عثة دودة الذرة من طعام ملوث. ووجدنا أن مبيدات الفطريات الجهازية والملامسة قللت من زيادة وزن النحل وزادت من معدل الوفيات، وارتبطت أشد الآثار بالمانكوزيب والبيريثيوبيد. ثم قارنا التنوع الميكروبي لليرقات التي تتغذى على نظام حبوب اللقاح المعالج بالمانكوزيب مع تلك التي تتغذى على النظام الغذائي المرجعي. ناقشنا الآليات المحتملة الكامنة وراء معدل الوفيات وآثارها على برامج الإدارة المتكاملة للآفات والملقحات (IPPM)36.
تم الحصول على شرانق O. cornifrons البالغة التي تقضي الشتاء في شرانق من مركز أبحاث الفاكهة، بيغلرفيل، بنسلفانيا، وتم تخزينها عند درجة حرارة -3 إلى 2 درجة مئوية (±0.3 درجة مئوية). قبل التجربة (600 شرنقة في المجموع). في مايو 2022، تم نقل 100 شرنقة من O. cornifrons يوميًا إلى أكواب بلاستيكية (50 شرنقة لكل كوب، قطر 5 سم × 15 سم) وتم وضع مناديل داخل الأكواب لتعزيز الفتح وتوفير ركيزة قابلة للمضغ، مما يقلل الضغط على النحل الحجري37. ضع كوبين بلاستيكيين يحتويان على شرانق في قفص حشرات (30 × 30 × 30 سم، BugDorm MegaView Science Co. Ltd.، تايوان) مع مغذيات سعة 10 مل تحتوي على محلول سكروز بنسبة 50٪ وتخزينها لمدة أربعة أيام لضمان الإغلاق والتزاوج. 23 درجة مئوية، رطوبة نسبية 60٪، فترة ضوئية 10 لتر (كثافة منخفضة): 14 يومًا. تم إطلاق 100 أنثى وذكر متزاوجة كل صباح لمدة ستة أيام (100 يوميًا) في عشين اصطناعيين أثناء ذروة ازدهار التفاح (عش الفخ: العرض 33.66 × الارتفاع 30.48 × الطول 46.99 سم؛ الشكل التكميلي 1). وُضعت هذه النباتات في حديقة ولاية بنسلفانيا النباتية، بالقرب من أشجار الكرز (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™)، والخوخ (Prunus persica 'Contender')، وPrunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®)، والكمثرى (Pyrus perifolia 'Olympic'، وPyrus perifolia 'Shinko'، وPyrus perifolia 'Shinseiki')، وشجرة تفاح كوروناريا (Malus coronavirusa)، والعديد من أنواع أشجار التفاح (Malus coronavirusa، Malus)، وشجرة تفاح منزلية (Co-op 30′ Enterprise™)، وشجرة تفاح مالوس (Co-Op 31′ Winecrisp™)، والبيغونيا (Freedom)، والبيغونيا (Golden Delicious)، والبيغونيا (Nova Spy). يُوضع كل بيت طيور بلاستيكي أزرق فوق صندوقين خشبيين. يحتوي كل صندوق تعشيش على 800 أنبوب ورق كرافت فارغ (مفتوح بشكل حلزوني، 0.8 سم قطر داخلي × 15 سم طول) (شركة جونزفيل لأنابيب الورق، ميشيغان) يتم إدخالها في أنابيب سيلوفان معتمة (0.7 قطر خارجي) انظر المقابس البلاستيكية (المقابس T-1X) توفر مواقع التعشيش.
كان كلا صندوقي التعشيش مواجهين للشرق ومغطيين بسياج بلاستيكي أخضر للحديقة (طراز Everbilt رقم 889250EB12، مقاس الفتحة 5 × 5 سم، 0.95 متر × 100 متر) لمنع وصول القوارض والطيور ووضعهما على سطح التربة بجوار صناديق تربة صندوق التعشيش. صندوق التعشيش (الشكل التكميلي 1أ). تم جمع بيض حفار الذرة يوميًا عن طريق جمع 30 أنبوبًا من الأعشاش ونقلها إلى المختبر. باستخدام المقص، قم بعمل قطع في نهاية الأنبوب، ثم قم بتفكيك الأنبوب الحلزوني للكشف عن خلايا الحضنة. تمت إزالة البيض الفردي وحبوب اللقاح الخاصة به باستخدام ملعقة منحنية (مجموعة أدوات Microslide، BioQuip Products Inc.، كاليفورنيا). تم تحضين البيض على ورق ترشيح رطب ووضعه في طبق بتري لمدة ساعتين قبل استخدامه في تجاربنا (الشكل التكميلي 1ب-د).
في المختبر، قمنا بتقييم السمية الفموية لستة مبيدات فطريات استُخدمت قبل وأثناء إزهار التفاح بثلاثة تركيزات (0.1X، 0.5X، و1X، حيث 1X هي العلامة المطبقة لكل 100 جالون من الماء/فدان. الجرعة الحقلية العالية = التركيز في الحقل). (الجدول 1). تكرر كل تركيز 16 مرة (ن = 16). سمية مبيدين فطريين ملامسين (الجدول S1: مانكوزيب 2696.14 جزء في المليون وكابتان 2875.88 جزء في المليون) وأربعة مبيدات فطريات جهازية (الجدول S1: بيريثيوستروبين 250.14 جزء في المليون؛ تريفلوكسيستروبين 110.06 جزء في المليون؛ ميكلوبوتانيل أزول 75.12 جزء في المليون؛ سيبرودينيل 280.845 جزء في المليون) على الفواكه والخضراوات والمحاصيل الزينة. قمنا بتجانس حبوب اللقاح باستخدام مطحنة، ونقلنا 0.20 غرام إلى بئر (طبق فالكون ذو 24 بئرًا)، وأضفنا وخلطنا ميكرولترًا واحدًا من محلول مبيد الفطريات لتكوين حبوب لقاح هرمية ذات آبار بعمق 1 مم وُضعت فيها البيضات. وُضعت باستخدام ملعقة صغيرة (الشكل التكميلي 1ج، د). خُزنت أطباق فالكون في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ورطوبة نسبية 70%. وقارناها بيرقات مجموعة التحكم التي تغذت على نظام غذائي متجانس من حبوب اللقاح وعولجت بالماء النقي. سجلنا معدل الوفيات وقسنا وزن اليرقات كل يومين حتى وصلت إلى عمر ما قبل العذراء باستخدام ميزان تحليلي (فيشر ساينتفك، دقة = 0.0001 غرام). وأخيرًا، قُيِّمت نسبة الجنس بفتح الشرنقة بعد شهرين ونصف.
استُخلص الحمض النووي من يرقات كاملة من نوع O. cornifrons (عددها 3 لكل حالة علاج، حبوب لقاح مُعالجة وغير مُعالجة بالمانكوزيب)، وأجرينا تحليلات للتنوع الميكروبي على هذه العينات، خاصةً وأن أعلى معدل وفيات سُجِّل في اليرقات التي تلقت المانكوزيب كان من نوع MnZn. ضُخِّم الحمض النووي، ونُقِّي باستخدام مجموعة DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (شركة Zymo Research، إرفين، كاليفورنيا)، وسُلِّس (600 دورة) على جهاز Illumina® MiSeq™ باستخدام مجموعة v3. أُجري تسلسل مُستهدف لجينات الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S البكتيرية باستخدام مجموعة Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (شركة Zymo Research، إرفين، كاليفورنيا) باستخدام بادئات تستهدف المنطقة V3-V4 من جين 16S rRNA. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تسلسل 18S باستخدام تضمين 10٪ PhiX، وتم إجراء التضخيم باستخدام زوج البادئ 18S001 و NS4.
استيراد ومعالجة القراءات المزدوجة39 باستخدام خط أنابيب QIIME2 (الإصدار 2022.11.1). تم تقليص هذه القراءات ودمجها، وأُزيلت التسلسلات الكيمرية باستخدام مكون DADA2 في QIIME2 (اقتران ضوضاء qiime dada2)40. تم تنفيذ تعيينات الفئتين 16S و18S باستخدام مكون تصنيف الكائنات Classify-sklearn والأداة المُدرَّبة مسبقًا silva-138-99-nb-classifier.
تم فحص جميع البيانات التجريبية للتحقق من انتظامها (اختبار شابيرو-ويلكس) وتجانس التباينات (اختبار ليفين). ولأن مجموعة البيانات لم تستوفِ افتراضات التحليل البارامتري، ولأن التحويل فشل في توحيد البقايا، أجرينا تحليل تباين ثنائي الاتجاه غير بارامتري (كروسكال-واليس) بعاملين [الوقت (ثلاث نقاط زمنية للمراحل 2 و5 و8 أيام) ومبيد الفطريات] لتقييم تأثير المعالجة على الوزن الطازج لليرقات، ثم أُجريت مقارنات زوجية غير بارامتري بعد التجربة باستخدام اختبار ويلكوكسون. استخدمنا نموذجًا خطيًا معممًا (GLM) مع توزيع بواسون لمقارنة آثار مبيدات الفطريات على البقاء عبر ثلاثة تركيزات من مبيدات الفطريات41،42. لتحليل الوفرة التفاضلية، تم تقليص عدد متغيرات تسلسل الأمبليكون (ASVs) على مستوى الجنس. أُجريت مقارنات للوفرة التفاضلية بين المجموعات باستخدام الوفرة النسبية لـ 16S (على مستوى الجنس) و18S باستخدام نموذج جمعي معمم للموقع والحجم والشكل (GAMLSS) مع توزيعات عائلات بيتا المتضخمة الصفرية (BEZI)، والتي نُمذجت على أساس كبير في ميكروبيوم R43 (الإصدار 1.1). 1. أُزيلت أنواع الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء قبل التحليل التفاضلي. ونظرًا لاختلاف المستويات التصنيفية لـ 18S، استُخدم أدنى مستوى لكل تصنيف فقط للتحليل التفاضلي. أُجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام R (الإصدار 3.4.3، مشروع CRAN) (فريق 2013).
أدى التعرض للمانكوزيب، والبيريثيوستروبين، والتريفلوكسيستروبين إلى انخفاض ملحوظ في زيادة وزن اليرقات (الشكل 1). ولوحظت هذه التأثيرات باستمرار في جميع الجرعات الثلاث التي خضعت للتقييم (الشكل 1أ-ج). ولم يُحدث السيكلوستروبين والميكلوبوتانيل انخفاضًا ملحوظًا في وزن اليرقات.
متوسط ​​الوزن الطازج ليرقات ثاقب الساق المقاسة في ثلاث نقاط زمنية تحت أربع معالجات غذائية (تغذية حبوب اللقاح المتجانسة + مبيد الفطريات: التحكم، جرعات 0.1X و0.5X و1X). (أ) جرعة منخفضة (0.1X): نقطة الوقت الأولى (اليوم 1): χ2: 30.99، DF = 6؛ P < 0.0001، نقطة الوقت الثانية (اليوم 5): 22.83، DF = 0.0009؛ المرة الثالثة؛ نقطة (اليوم 8): χ2: 28.39، DF = 6؛ (ب) نصف الجرعة (0.5X): نقطة الوقت الأولى (اليوم 1): χ2: 35.67، DF = 6؛ P < 0.0001، نقطة الوقت الثانية (اليوم الأول). ): χ2: 15.98، DF = 6؛ P = 0.0090؛ النقطة الزمنية الثالثة (اليوم الثامن): χ2: 16.47، DF = 6؛ (ج) موضع الجرعة أو الجرعة الكاملة (مرة واحدة): النقطة الزمنية الأولى (اليوم الأول): χ2: 20.64، P = 6؛ P = 0.0326؛ النقطة الزمنية الثانية (اليوم الخامس): χ2: 22.83، DF = 6؛ P = 0.0009؛ النقطة الزمنية الثالثة (اليوم الثامن): χ2: 28.39، DF = 6؛ تحليل التباين غير المعلمي. تمثل الأعمدة المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمقارنات الزوجية (α = 0.05) (ن = 16) *P ≤ 0.05، **P ≤ 0.001، ***P ≤ 0.0001.
عند أقل جرعة (0.1X)، انخفض وزن اليرقات بنسبة 60% باستخدام تريفلوكسيستروبين، و49% باستخدام مانكوزيب، و48% باستخدام ميكلوبوتانيل، و46% باستخدام بيريثيستروبين (الشكل 1أ). عند التعرض لنصف الجرعة الميدانية (0.5X)، انخفض وزن يرقات مانكوزيب بنسبة 86%، و52% باستخدام بيريثيستروبين، و50% باستخدام تريفلوكسيستروبين (الشكل 1ب). أما الجرعة الميدانية الكاملة (1X) من مانكوزيب، فقد انخفضت وزن اليرقات بنسبة 82%، و70% باستخدام بيريثيستروبين، و30% تقريبًا باستخدام تريفلوكسيستروبين ومايكلوبوتانيل وسانجارد (الشكل 1ج).
كان معدل الوفيات أعلى بين اليرقات التي تغذت على حبوب لقاح مُعالجة بالمانكوزيب، يليها البيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين. ازداد معدل الوفيات بزيادة جرعات المانكوزيب والبيريتيسولين (الشكل 2؛ الجدول 2). إلا أن معدل وفيات ثاقبة الذرة لم يرتفع إلا قليلاً مع زيادة تركيزات التريفلوكسيستروبين؛ ولم يُحدث السيبرودينيل والكابتان زيادة ملحوظة في معدل الوفيات مقارنةً بمعاملات الضبط.
قورنت معدلات نفوق يرقات ذبابة الثاقبة بعد تناول حبوب اللقاح المعالجة بشكل فردي بستة مبيدات فطريات مختلفة. كان المانكوزيب والبنتوبيرامايد أكثر حساسية للتعرض الفموي ليرقات الذرة (GLM: χ = 29.45، DF = 20، P = 0.0059) (الخط، الميل = 0.29، P < 0.001؛ الميل = 0.24، P < 0.00)).
في المتوسط، في جميع العلاجات، كانت نسبة الإناث 39.05% والذكور 60.95%. في علاجات الضبط، بلغت نسبة الإناث 40% في كلٍّ من دراسات الجرعة المنخفضة (0.1X) ونصف الجرعة (0.5X)، و30% في دراسات الجرعة الميدانية (1X). عند جرعة 0.1X، كانت نسبة الإناث 33.33% من اليرقات البالغة التي تتغذى على حبوب اللقاح والمعالجة بالمانكوزيب والميكلوبوتانيل، و22% من اليرقات البالغة، و44% من اليرقات البالغة، و44% من اليرقات البالغة. كانت نسبة الإناث 41% من اليرقات البالغة، بينما بلغت نسبة الإناث في مجموعة الضبط 31% (الشكل 3أ). عند إعطاء جرعة مضاعفة بمقدار ٠.٥ مرة، كانت نسبة الإناث ٣٣٪ من الديدان البالغة في مجموعة المانكوزيب والبيريثيوستروبين، و٣٦٪ في مجموعة التريفلوكسيستروبين، و٤١٪ في مجموعة الميكلوبوتانيل، و٤٦٪ في مجموعة السيبروستروبين. وبلغت هذه النسبة ٥٣٪ في مجموعة الكابتان، و٣٨٪ في مجموعة الضبط (الشكل ٣ب). عند إعطاء جرعة مضاعفة بمقدار ١ مرة، كانت نسبة الإناث ٣٠٪ في مجموعة المانكوزيب، و٣٦٪ في مجموعة البيريثيوستروبين، و٤٤٪ في مجموعة التريفلوكسيستروبين، و٣٨٪ في مجموعة الميكلوبوتانيل، و٥٠٪ في مجموعة الضبط (٣٨.٥٪) (الشكل ٣ج).
النسبة المئوية للذكور والإناث من حشرات المثقبيات بعد التعرض لمبيد الفطريات في مرحلة اليرقات. (أ) جرعة منخفضة (0.1X). ​​(ب) نصف الجرعة (0.5X). (ج) جرعة ميدانية أو جرعة كاملة (1X).
أظهر تحليل تسلسل 16S أن المجموعة البكتيرية اختلفت بين اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزيب واليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح غير المعالجة (الشكل 4أ). كان المؤشر الميكروبي لليرقات غير المعالجة التي تتغذى على حبوب اللقاح أعلى من مؤشر اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة بالمانكوزيب (الشكل 4ب). وعلى الرغم من أن الاختلاف الملحوظ في الثراء بين المجموعات لم يكن ذا دلالة إحصائية، إلا أنه كان أقل بكثير من الاختلاف الملحوظ لليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح غير المعالجة (الشكل 4ج). وأظهرت الوفرة النسبية أن ميكروبيوتا اليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح الضابطة كانت أكثر تنوعًا من تلك التي تتغذى على اليرقات التي تتغذى على اليرقات المعالجة بالمانكوزيب (الشكل 5أ). وكشف التحليل الوصفي عن وجود 28 جنسًا في العينات الضابطة والمعالجة بالمانكوزيب (الشكل 5ب). ولم يكشف التحليل باستخدام تسلسل 18S عن أي اختلافات كبيرة (الشكل التكميلي 2).
تمت مقارنة ملفات تعريف SAV المستندة إلى تسلسلات 16S مع ثراء شانون، والثراء الملحوظ على مستوى الشعبة. (أ) تحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA) المستند إلى البنية الكلية للمجتمع الميكروبي في اليرقات غير المعالجة التي تتغذى على حبوب اللقاح أو المجموعة الضابطة (الأزرق) والتي تتغذى على المانكوزب (البرتقالي). تمثل كل نقطة بيانات عينة منفصلة. حُسب تحليل الإحداثيات الرئيسية باستخدام مسافة براي-كورتيس لتوزيع t متعدد المتغيرات. تمثل الأشكال البيضاوية مستوى ثقة 80%. (ب) مخطط صندوقي، بيانات ثراء شانون الخام (نقاط)، و(ج) الثراء الملحوظ. تُظهر المخططات الصندوقية مربعات للخط المتوسط، والمدى الربيعي (IQR)، و1.5 × IQR (n = 3).
تكوين المجتمعات الميكروبية لليرقات التي تتغذى على حبوب اللقاح المعالجة وغير المعالجة بالمانكوزيب. (أ) الوفرة النسبية لقراءات الأجناس الميكروبية في اليرقات. (ب) خريطة حرارية للمجتمعات الميكروبية المحددة. دلفتيا (نسبة الأرجحية = 0.67، P = 0.0030) والزائفة الزنجارية (OR = 0.3، P = 0.0074)، ميكروباكتيريوم (OR = 0.75، P = 0.0617) (OR = 1.5، P = 0.0060)؛ رُتِّبت صفوف الخريطة الحرارية باستخدام مسافة الارتباط ومتوسط ​​الاتصال.
تُظهر نتائجنا أن التعرض الفموي لمبيدات الفطريات التلامسية (المانكوزيب) والجهازية (البايروستروبين والتريفلوكسيستروبين)، المُستخدمة على نطاق واسع خلال فترة الإزهار، قد قلل بشكل ملحوظ من زيادة الوزن وزيادة معدل نفوق يرقات الذرة. بالإضافة إلى ذلك، قلل المانكوزيب بشكل ملحوظ من تنوع وثراء الميكروبيوم خلال مرحلة ما قبل العذراء. أما الميكلوبوتانيل، وهو مبيد فطريات جهازي آخر، فقد قلل بشكل ملحوظ من زيادة وزن اليرقات في جميع الجرعات الثلاث. وقد ظهر هذا التأثير بوضوح في نقطتي الوقت الثانية (اليوم الخامس) والثالثة (اليوم الثامن). في المقابل، لم يُقلل السيبرودينيل والكابتان بشكل ملحوظ من زيادة الوزن أو معدل البقاء على قيد الحياة مقارنةً بالمجموعة الضابطة. وعلى حد علمنا، يُعد هذا العمل الأول الذي يحدد آثار المعدلات الحقلية لمبيدات الفطريات المختلفة المستخدمة لحماية محاصيل الذرة من التعرض المباشر لحبوب اللقاح.
أدت جميع معالجات مبيدات الفطريات إلى انخفاض ملحوظ في زيادة وزن الجسم مقارنةً بمعالجات الضبط. وكان للمانكوزيب التأثير الأكبر على زيادة وزن اليرقات، بمتوسط ​​انخفاض بلغ 51%، يليه البيريثيوستروبين. ومع ذلك، لم تُبلغ دراسات أخرى عن آثار جانبية للجرعات الحقلية من مبيدات الفطريات على مراحل اليرقات44. على الرغم من أن مبيدات ثنائي ثيوكاربامات الحيوية قد ثبت أن سميتها الحادة منخفضة45، إلا أن ثنائي ثيوكاربامات الإيثيلين (EBDCS) مثل المانكوزيب يمكن أن تتحلل إلى كبريتيد الإيثيلين اليوريا. ونظرًا لتأثيراتها الطفرية على الحيوانات الأخرى، فقد يكون ناتج التحلل هذا مسؤولًا عن التأثيرات الملحوظة46،47. وقد أظهرت دراسات سابقة أن تكوين ثيويوريا الإيثيلين يتأثر بعوامل مثل ارتفاع درجة الحرارة48، ومستويات الرطوبة49، وطول مدة تخزين المنتج50. ويمكن لظروف التخزين المناسبة للمبيدات الحيوية أن تخفف من هذه الآثار الجانبية. وعلاوة على ذلك، أعربت هيئة سلامة الأغذية الأوروبية عن قلقها بشأن سمية مادة البيريثيوبيد، التي ثبت أنها مسببة للسرطان في الجهاز الهضمي للحيوانات الأخرى51.
يزيد تناول المانكوزيب والبيريثيوستروبين والتريفلوكسيستروبين عن طريق الفم من معدل نفوق يرقات ثاقب الذرة. في المقابل، لم يكن للميكلوبوتانيل والسيبروسيكلين والكابتان أي تأثير على معدل النفوق. تختلف هذه النتائج عن نتائج لادورنر وآخرين، الذين أظهروا أن الكابتان قلل بشكل ملحوظ من معدل بقاء اليرقات البالغة من نوع O. lignaria وApis mellifera L. (غشائيات الأجنحة، Apisidae). بالإضافة إلى ذلك، وُجد أن مبيدات الفطريات مثل الكابتان والبوسكاليد تسبب نفوق اليرقات52،53،54 أو تغير سلوك التغذية55. يمكن أن تؤثر هذه التغييرات بدورها على الجودة الغذائية لحبوب اللقاح، وبالتالي على اكتساب اليرقات للطاقة. كان معدل النفوق الملحوظ في المجموعة الضابطة متوافقًا مع دراسات أخرى56،57.
يمكن تفسير نسبة الذكور المفضّلة للجنس، التي لوحظت في دراستنا، بعوامل مثل قلة التزاوج وسوء الأحوال الجوية أثناء الإزهار، كما اقترح فيسينس وبوش سابقًا بالنسبة لنحل العسل O. cornuta. على الرغم من أن الإناث والذكور في دراستنا كان لديهم أربعة أيام للتزاوج (وهي فترة تُعتبر عادةً كافية لنجاح التزاوج)، فقد خفّضنا شدة الضوء عمدًا لتقليل الإجهاد. ومع ذلك، قد يتداخل هذا التعديل دون قصد مع عملية التزاوج61. بالإضافة إلى ذلك، يتعرض النحل لعدة أيام من سوء الأحوال الجوية، بما في ذلك الأمطار وانخفاض درجات الحرارة (أقل من 5 درجات مئوية)، مما قد يؤثر سلبًا على نجاح التزاوج4،23.
على الرغم من أن دراستنا ركزت على ميكروبيوم اليرقات بأكمله، إلا أن نتائجنا تُقدم نظرة ثاقبة على العلاقات المحتملة بين المجتمعات البكتيرية التي قد تكون حاسمة لتغذية النحل وتعرضه لمبيدات الفطريات. على سبيل المثال، أظهرت اليرقات التي تتغذى على حبوب لقاح مُعالجة بالمانكوزيب انخفاضًا ملحوظًا في بنية المجتمع الميكروبي ووفرته مقارنةً باليرقات التي تتغذى على حبوب لقاح غير مُعالجة. في اليرقات التي تستهلك حبوب لقاح غير مُعالجة، كانت المجموعتان البكتيريتان بروتيوباكتيريا وأكتينوبكتيريا هي السائدة، وكانتا هوائيتين في الغالب أو هوائيتين اختياريتين. من المعروف أن بكتيريا دلفت، التي ترتبط عادةً بأنواع النحل الانفرادي، لها نشاط مضاد حيوي، مما يشير إلى دور وقائي محتمل ضد مسببات الأمراض. كان نوع بكتيري آخر، وهو الزائفة الزنجارية، وفيرًا في اليرقات التي تتغذى على حبوب لقاح غير مُعالجة، ولكنه انخفض بشكل ملحوظ في اليرقات المُعالجة بالمانكوزيب. تدعم نتائجنا الدراسات السابقة التي حددت الزائفة الزنجارية كواحدة من أكثر الأجناس وفرة في دبور النحل ثنائي القرن O. bicornis35 وغيره من الدبابير الانفرادية34. على الرغم من عدم دراسة الأدلة التجريبية على دور الزائفة الزنجارية في صحة خنفساء الكورنيفرون، فقد ثبت أن هذه البكتيريا تعزز تخليق السموم الوقائية في خنفساء Paederus fuscipes، وتعزز استقلاب الأرجينين في المختبر 35، 65. تشير هذه الملاحظات إلى دور محتمل لها في الدفاع الفيروسي والبكتيري خلال فترة نمو يرقات الكورنيفرون. الميكروباكتيريوم هو جنس آخر تم تحديده في دراستنا، ويُقال إنه موجود بأعداد كبيرة في يرقات ذبابة الجندي الأسود في ظروف المجاعة 66. في يرقات الكورنيفرون، قد تساهم الميكروبات في توازن ومرونة ميكروبيوم الأمعاء في ظروف الإجهاد. بالإضافة إلى ذلك، توجد بكتيريا رودوكوكوس في يرقات الكورنيفرون، وهي معروفة بقدرتها على إزالة السموم 67. يوجد هذا الجنس أيضًا في أمعاء الفلوريا، ولكن بكميات قليلة جدًا 68. تُظهر نتائجنا وجود اختلافات جينية متعددة عبر العديد من الأصناف الميكروبية، والتي قد تُغيّر العمليات الأيضية لدى اليرقات. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة إلى فهم أفضل للتنوع الوظيفي لـ O. cornifrons.
باختصار، تشير النتائج إلى أن المانكوزيب، والبيريثيوستروبين، والتريفلوكسيستروبين قللت من زيادة وزن الجسم وزادت من نفوق يرقات ثاقب الذرة. على الرغم من تزايد القلق بشأن آثار مبيدات الفطريات على الملقحات، إلا أن هناك حاجة إلى فهم أفضل لآثار المستقلبات المتبقية من هذه المركبات. يمكن دمج هذه النتائج في توصيات لبرامج إدارة الملقحات المتكاملة التي تساعد المزارعين على تجنب استخدام بعض مبيدات الفطريات قبل وأثناء إزهار أشجار الفاكهة، وذلك باختيار مبيدات الفطريات وتغيير توقيت الرش، أو بتشجيع استخدام بدائل أقل ضررًا. 36. تُعد هذه المعلومات مهمة لوضع توصيات بشأن استخدام المبيدات، مثل تعديل برامج الرش الحالية وتغيير توقيت الرش عند اختيار مبيدات الفطريات أو تشجيع استخدام بدائل أقل ضررًا. هناك حاجة إلى مزيد من البحث في الآثار الضارة لمبيدات الفطريات على نسبة الجنس، وسلوك التغذية، وميكروبيوم الأمعاء، والآليات الجزيئية الكامنة وراء فقدان وزن ثاقب الذرة ونفوقه.
تم إيداع بيانات المصدر ١ و٢ و٣ في الشكلين ١ و٢ في مستودع بيانات figshare، المعرف الرقمي (DOI): https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 وhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. التسلسلات التي حُللت في الدراسة الحالية (الشكلان ٤ و٥) متاحة في مستودع NCBI SRA برقم الوصول PRJNA1023565.
بوش، ج. وكيمب، و. ب. تطوير وترسيخ أنواع نحل العسل كملقحات للمحاصيل الزراعية: مثال جنس أوزميا (غشائيات الأجنحة: ميجاشيليدي) وأشجار الفاكهة. ثور. نوتومور. مورد. 92، 3-16 (2002).
باركر، إم جي وآخرون. ممارسات التلقيح وتصورات الملقحات البديلة بين مزارعي التفاح في نيويورك وبنسلفانيا. تحديث. الزراعة. أنظمة الغذاء. 35، 1-14 (2020).
كوخ آي، لونسدورف إي دبليو، آرتز دي آر، بيتس-سينجر تي إل، وريكيتس تي إتش: بيئة واقتصاديات تلقيح اللوز باستخدام النحل المحلي. مجلة الاقتصاد. نوتومور. 111، 16-25 (2018).
لي، إي.، هي، واي.، وبارك، واي.-إل. آثار تغير المناخ على ظواهر نبات التراجوبان: تداعياتها على إدارة السكان. مجلة كلايمب. تشينج، 150، 305-317 (2018).
آرتز، د.ر. وبيتس-سينجر، ت.ل. تأثير رش مبيدات الفطريات والمواد المساعدة على سلوك التعشيش لنحلين منفردين مُدَرَّبين (أوسميا ليجناريا وميجاشيلي روتونداتا). مجلة بلوس وان، العدد 10، e0135688 (2015).
بوفيه، س. وآخرون. مبيد فطريات محاصيل منخفض السمية (فينبوكونازول) يتداخل مع إشارات جودة التكاثر الذكرية، مما يؤدي إلى انخفاض نجاح التزاوج لدى النحل البري الانفرادي. مجلة تطبيقات علم البيئة، 59، 1596-1607 (2022).
سغولاسترا ف. وآخرون. مبيدات النيونيكوتينويد الحشرية وتخليق الإرغوستيرول يُثبطان معدل الوفيات الناتج عن مبيدات الفطريات التآزرية في ثلاثة أنواع من النحل. مكافحة الآفات. مجلة العلوم. 73، 1236-1243 (2017).
Kuhneman JG، Gillung J، Van Dyck MT، Fordyce RF. و Danforth BN. تعمل يرقات الدبابير الانفرادية على تغيير التنوع البكتيري الذي توفره حبوب اللقاح للنحل الذي يعشش في الجذع Osmia cornifrons (Megachilidae). front. microorganism. 13، 1057626 (2023).
دارامبال ب.س، دانفورث ب.ن وستيفان س.أ. تعتبر الكائنات الحية الدقيقة التكافلية الخارجية في حبوب اللقاح المخمرة مهمة لنمو النحل الانفرادي مثل حبوب اللقاح نفسها. علم البيئة. التطور. 12. e8788 (2022).
كيلدرير م، مانيسي ل.م، كابوتو ف، ثالهايمر م. الزراعة بين الصفوف في بساتين التفاح لمكافحة أمراض إعادة البذر: دراسة عملية للفعالية بناءً على المؤشرات الميكروبية. تربة النبات، 357، 381-393 (2012).
مارتن ب.ل، كرافشيك ت.، خدادادي ف.، أخيموفيتش س.ج.، وبيتر ك.أ.، العفن المر للتفاح في منطقة وسط المحيط الأطلسي بالولايات المتحدة: تقييم الأنواع المسببة وتأثير الظروف الجوية الإقليمية وقابلية الأصناف للإصابة. علم أمراض النبات 111، 966-981 (2021).
كولين إم جي، تومسون إل جيه، كارولان جيه كيه، ستاوت جيه كيه، وستانلي دي إيه. مبيدات الفطريات والأعشاب والنحل: مراجعة منهجية للأبحاث والأساليب الحالية. مجلة بلوس وان، العدد 14، e0225743 (2019).
بيلينج، إي دي وجيبسون، بي سي التأثيرات التآزرية لمبيدات الفطريات EBI ومبيدات الحشرات البيرثرويدية على نحل العسل (Apis mellifera). الآفات العلمية. 39، 293-297 (1993).
موسن، إي سي، لوبيز، جي إي، وبينج، سي واي. تأثير مبيدات فطريات مختارة على نمو وتطور يرقات نحل العسل Apis mellifera L. (غشائيات الأجنحة: Apidae). الأربعاء. نوتومور. 33، 1151-1154 (2004).
فان دايك، م.، مولين، إي.، ويكستيد، دي.، وماك آرت، إس. دليل القرار لاستخدام المبيدات لحماية الملقحات في بساتين الأشجار (جامعة كورنيل، 2018).
إيواساكي، ج.م. وهوغندورن، ك. تعرض النحل للمواد غير المُبيدة: مراجعة للأساليب والنتائج المُبلغ عنها. الزراعة. النظام البيئي. الأربعاء. 314، 107423 (2021).
كوبيت أ.م، كلينجر إي، كوكس-فوستر دي إل، راميريز ر.أ، بيتس-سينجر تي إل. تأثير نوع الإمداد والتعرض للمبيدات الحشرية على نمو يرقات حشرة أوزميا ليجناريا (غشائيات الأجنحة: ميجاشيليداي). الأربعاء. نوتومور. 51، 240-251 (2022).
كوبيت إيه إم وبيتس-سينجر تي إل. مسارات تعرض النحل الانفرادي في العش الفارغ للمبيدات الحشرية. الأربعاء. نوتومور. 47، 499-510 (2018).
بان، ن. ت. وآخرون. بروتوكول جديد لاختبار تناول المبيدات لتقييم سمية المبيدات لدى نحل الحدائق الياباني البالغ (Osmia cornifrons). مجلة العلوم. التقارير 10، 9517 (2020).