تقييم اليود والأفيرمكتين كمحفزات لمرض النيماتودا في الصنوبر

نيماتودا الصنوبر طفيلي داخلي مهاجر في الحجر الصحي، يُعرف عنه أنه يسبب خسائر اقتصادية فادحة في النظم البيئية لغابات الصنوبر. تستعرض هذه الدراسة النشاط القاتل للنيماتودا للإندولات المهلجنة ضد نيماتودا الصنوبر وآلية عملها. كانت الأنشطة القاتلة للنيماتودا لكل من 5-يودوإندول وأفيرمكتين (مجموعة ضابطة إيجابية) ضد نيماتودا الصنوبر متشابهة ومرتفعة عند تركيزات منخفضة (10 ميكروغرام/مل). أدى 5-يودوإندول إلى انخفاض الخصوبة، والنشاط التكاثري، ومعدل وفيات الأجنة واليرقات، والسلوك الحركي. تدعم التفاعلات الجزيئية للربيطات مع مستقبلات قنوات الكلوريد المعتمدة على الغلوتامات الخاصة باللافقاريات فكرة أن 5-يودوإندول، مثل أفيرمكتين، يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالموقع النشط للمستقبل. كما حفّز 5-يودو إندول تشوهاتٍ ظاهريةً مختلفةً في الديدان الخيطية، بما في ذلك انهيار/انكماش غير طبيعي للأعضاء وزيادة تكوّن الفجوات. تشير هذه النتائج إلى أن الفجوات قد تلعب دورًا في موت الديدان الخيطية بوساطة الميثيل. والجدير بالذكر أن 5-يودو إندول لم يكن سامًا لكلا النوعين النباتيين (الملفوف والفجل). وبالتالي، تُظهر هذه الدراسة أن استخدام اليودو إندول في ظل الظروف البيئية يُمكن أن يُساعد في الحد من إصابة ذبول الصنوبر.
تنتمي نيماتودا خشب الصنوبر (Bursaphelenchus xylophilus) إلى نيماتودا خشب الصنوبر (PWN)، وهي نيماتودا طفيلية مهاجرة تُعرف بتسببها في أضرار بيئية جسيمة للنظم البيئية لغابات الصنوبر1. يُصبح مرض ذبول الصنوبر (PWD) الذي تُسببه نيماتودا خشب الصنوبر مشكلة خطيرة في عدة قارات، بما في ذلك آسيا وأوروبا، وفي أمريكا الشمالية، تُدمر هذه النيماتودا أنواع الصنوبر المُستوردة1،2. يُعد تدهور أشجار الصنوبر مشكلة اقتصادية رئيسية، واحتمال انتشارها عالميًا أمرٌ مُقلق3. أكثر أنواع الصنوبر التي تُهاجمها النيماتودا شيوعًا هي: الصنوبر الكثيف الأزهار، والصنوبر السيلفيستري، والصنوبر الثونبرجي، والصنوبر الكوري، والصنوبر الثونبرجي، والصنوبر المُشعّ4. تُعد نيماتودا الصنوبر مرضًا خطيرًا يُمكن أن يُودي بحياة أشجار الصنوبر في غضون أسابيع أو أشهر من الإصابة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تفشي الديدان الخيطية الصنوبرية أمر شائع في مجموعة متنوعة من النظم البيئية، وبالتالي تم إنشاء سلاسل عدوى مستمرة1.
Bursaphelenchus xylophilus دودة خيطية متطفلة على النباتات، تعيش في الحجر الصحي، وتنتمي إلى الفصيلة الفرعية Aphelenchoidea والفرع 102.5. تتغذى هذه الدودة على الفطريات وتتكاثر في أنسجة خشب أشجار الصنوبر، وتتطور إلى أربع مراحل يرقية مختلفة: L1، L2، L3، L4، وفرد بالغ1،6. في ظل نقص الغذاء، تنتقل دودة الصنوبر الخيطية إلى مرحلة يرقية متخصصة - داور - تتطفل على ناقلها - خنفساء لحاء الصنوبر (Monochamus alternatus)، وتنتقل إلى أشجار الصنوبر السليمة. في العوائل السليمة، تهاجر الديدان الخيطية بسرعة عبر أنسجة النبات وتتغذى على الخلايا البرنشيمية، مما يؤدي إلى عدد من ردود الفعل التحسسية المفرطة، وذبول الصنوبر، وموته في غضون عام من الإصابة1،7،8.
لطالما شكّلت المكافحة البيولوجية لديدان الصنوبر الخيطية تحديًا، حيث يعود تاريخ إجراءات الحجر الصحي إلى القرن العشرين. وتتضمن الاستراتيجيات الحالية لمكافحة ديدان الصنوبر الخيطية بشكل أساسي المعالجات الكيميائية، بما في ذلك تبخير الأخشاب وزرع مبيدات النيماتودا في جذوع الأشجار. ومن أكثر مبيدات النيماتودا شيوعًا: أفيرمكتين وبنزوات أفيرمكتين، وهما من عائلة أفيرمكتين. وتتميّز هذه المواد الكيميائية باهظة الثمن بفعاليتها العالية ضد العديد من أنواع النيماتودا، وتُعتبر آمنة بيئيًا. ومع ذلك، يُتوقع أن يُؤدي الاستخدام المتكرر لهذه المبيدات إلى ضغط انتقائي، مما سيؤدي على الأرجح إلى ظهور ديدان صنوبر خيطية مقاومة، كما ثبت في العديد من الآفات الحشرية، مثل Leptinotarsa ​​​​decemlineata وPlutella xylostella، والديدان الخيطية Trichostrongylus colubriformis وOstertagia circumcincta، التي طورت تدريجيًا مقاومة للأفيرمكتين. لذلك، يجب دراسة أنماط المقاومة بانتظام وفحص مبيدات النيماتودا باستمرار لإيجاد تدابير بديلة فعّالة من حيث التكلفة وصديقة للبيئة لمكافحة مرض داء الخيطيات الوعائية (PVD). في العقود الأخيرة، اقترح عدد من الباحثين استخدام مستخلصات نباتية وزيوت عطرية ومواد متطايرة كعوامل لمكافحة النيماتودا.13،14،15،16
لقد أثبتنا مؤخرًا النشاط القاتل للنيماتودا للإندول، وهو جزيء إشارات بين الخلايا وبين الممالك، في دودة الربداء الرشيقة Caenorhabditis elegans 17. يُعد الإندول إشارة خلوية واسعة الانتشار في علم البيئة الميكروبية، حيث يتحكم في العديد من الوظائف التي تؤثر على وظائف الجسم الميكروبية، وتكوين الأبواغ، واستقرار البلازميد، ومقاومة الأدوية، وتكوين الأغشية الحيوية، والضراوة 18، ​​19. لم تتم دراسة نشاط الإندول ومشتقاته ضد النيماتودا المسببة للأمراض الأخرى. في هذه الدراسة، بحثنا في النشاط القاتل للنيماتودا لـ 34 إندول ضد نيماتودا الصنوبر، وأوضحنا آلية عمل أقوى 5-يودوإندول باستخدام المجهر والتصوير الفوتوغرافي الفاصل الزمني وتجارب الالتحام الجزيئي، وقيمنا آثاره السامة على النباتات باستخدام اختبار إنبات البذور.
سبق الإبلاغ عن تأثيرٍ مُبيدٍ للنيماتودا بتركيزاتٍ عالية (>1.0 ملي مولار) من الإندول على النيماتودا.17 بعد معالجة بكتيريا زيلوفيلس (مراحل الحياة المختلطة) بالإندول أو 33 مُشتقًا مُختلفًا من مُشتقات الإندول بتركيز 1 ملي مولار، قُيسَ معدل نفوق بكتيريا زيلوفيلس بإحصاء النيماتودا الحية والميتة في المجموعتين الضابطة والمعالجة. أظهرت خمسة إندولات نشاطًا مُبيدًا للنيماتودا بشكلٍ ملحوظ؛ بينما بلغت نسبة بقاء المجموعة الضابطة غير المُعالجة 95 ± 7% بعد 24 ساعة. من بين 34 إندولًا خضعت للاختبار، تسبب 5-يودوإندول و4-فلوروإندول بتركيز 1 ملي مولار في نفوق بنسبة 100%، بينما تسبب 5،6-دايفلوروإندول، وميثيل إندول-7-كاربوكسيلات، و7-يودوإندول في نفوق بنسبة 50% تقريبًا (الجدول 1).
تأثير 5-يودو إندول على تكوين الفجوات واستقلاب نيماتودا خشب الصنوبر. (أ) تأثير أفيرمكتين و5-يودو إندول على ذكور النيماتودا البالغة، (ب) بيض النيماتودا في المرحلة L1، و(ج) استقلاب بكتيريا ب. إكسيلوفيلوس. (أ) لم تُلاحظ فجوات بعد 0 ساعة، وأدى العلاج إلى: (ب) فجوات، (ج) تراكم فجوات متعددة، (د) تورم الفجوات، (هـ) اندماج الفجوات، و(و) تكوين فجوات عملاقة. تشير الأسهم الحمراء إلى تورم الفجوات، والأسهم الزرقاء إلى اندماج الفجوات، والأسهم السوداء إلى فجوات عملاقة. مقياس الرسم = 50 ميكرومتر.
بالإضافة إلى ذلك، وصفت هذه الدراسة أيضًا العملية المتسلسلة للموت الناجم عن الميثان في خيطيات الصنوبر (الشكل 4 ج). الموت الميثاني هو نوع غير موت خلوي مرتبط بتراكم فجوات سيتوبلازمية بارزة27. يبدو أن العيوب المورفولوجية التي لوحظت في خيطيات الصنوبر مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بآلية الموت الناجم عن الميثان. أظهر الفحص المجهري في أوقات مختلفة أن فجوات عملاقة تشكلت بعد 20 ساعة من التعرض لـ 5-يودو إندول (0.1 ملي مولار). لوحظت فجوات مجهرية بعد 8 ساعات من العلاج، وزاد عددها بعد 12 ساعة. لوحظت عدة فجوات كبيرة بعد 14 ساعة. كانت عدة فجوات ملتحمة مرئية بوضوح بعد 12-16 ساعة من العلاج، مما يشير إلى أن اندماج الفجوات هو أساس آلية الموت الميثاني. بعد 20 ساعة، تم العثور على عدة فجوات عملاقة في جميع أنحاء الدودة. تمثل هذه الملاحظات أول تقرير عن الانقسام الفتيلي في الديدان الأسطوانية C. elegans.
في الديدان المعالجة بـ 5-يودوإندول، لوحظ أيضًا تجمع الفجوات وتمزقها (الشكل 5)، كما يتضح من انحناء الدودة وانطلاق الفجوات في البيئة. كما لوحظ تمزق الفجوات في غشاء قشرة البيض، الذي عادةً ما يحافظ عليه L2 سليمًا أثناء الفقس (الشكل التكميلي S2). تدعم هذه الملاحظات تورط تراكم السوائل وفشل التنظيم الأسموزي، بالإضافة إلى إصابة الخلايا القابلة للعكس (RCI)، في عملية تكوين الفجوات وتقيحها (الشكل 5).
بافتراض دور اليود في تكوين الفجوات العصارية المرصودة، درسنا النشاط القاتل للديدان الخيطية ليوديد الصوديوم (NaI) ويوديد البوتاسيوم (KI). مع ذلك، عند تركيزات (0.1، 0.5 أو 1 ملي مولار)، لم يؤثرا على بقاء الديدان الخيطية أو تكوين الفجوات العصارية (الشكل التكميلي S5)، على الرغم من أن تركيز 1 ملي مولار من يوديد البوتاسيوم كان له تأثير طفيف في قتل الديدان الخيطية. من ناحية أخرى، حفز 7-يودو إندول (1 أو 2 ملي مولار)، مثل 5-يودو إندول، تكوين فجوات عصارية متعددة وتشوهات هيكلية (الشكل التكميلي S6). أظهر اليود وإندول خصائص ظاهرية متشابهة في ديدان الصنوبر الخيطية، بينما لم يظهر NaI وKI أي خصائص. ومن المثير للاهتمام أن الإندول لم يحفز تكوين الفجوات العصارية في B. xylophilus عند التركيزات المختبرة (البيانات غير معروضة). وبذلك أكدت النتائج أن مركب الإندول-اليود هو المسؤول عن تكون الفجوات واستقلاب البكتيريا العصوية إكسيلوفيلوس.
من بين الإندولات التي تم اختبار نشاطها القاتل للديدان الخيطية، كان لدى 5-يودو إندول أعلى مؤشر انزلاق بلغ -5.89 كيلو كالوري/مول، يليه 7-يودو إندول (-4.48 كيلو كالوري/مول)، و4-فلورو إندول (-4.33)، والإندول (-4.03) (الشكل 6). تعمل الرابطة الهيدروجينية القوية بين 5-يودو إندول والليوسين 218 على تثبيت ارتباطه، بينما ترتبط جميع مشتقات الإندول الأخرى بالسرين 260 عبر روابط هيدروجينية في السلسلة الجانبية. من بين اليودوإندولات النموذجية الأخرى، يمتلك 2-يودوإندول قيمة ارتباط -5.248 كيلو كالوري/مول، وهو ما يرجع إلى الرابطة الهيدروجينية الرئيسية مع الليوسين 218. تشمل الروابط الأخرى المعروفة 3-يودوإندول (-4.3 كيلو كالوري/مول)، و4-يودوإندول (-4.0 كيلو كالوري/مول)، و6-فلوروإندول (-2.6 كيلو كالوري/مول) (الشكل التكميلي S8). تُشكّل معظم الإندولات المهلجنة والإندول نفسه، باستثناء 5-يودوإندول و2-يودوإندول، رابطة مع السيرين 260. ويدلّ تكوين رابطة هيدروجينية مع الليوسين 218 على كفاءة ارتباط المستقبل بالربيط، كما لوحظ في حالة الإيفرمكتين (الشكل التكميلي S7)، على أن 5-يودوإندول و2-يودوإندول، مثل الإيفرمكتين، يرتبطان بإحكام بالموقع النشط لمستقبل GluCL عبر الليوسين 218 (الشكل 6 والشكل التكميلي S8). ونقترح أن هذا الارتباط ضروري للحفاظ على بنية المسام المفتوحة لمركب GluCL، وأن 5-يودوإندول و2-يودوإندول وأفيرمكتين، من خلال ارتباطهما بإحكام بالموقع النشط لمستقبل GluCL، يُحافظ كلٌّ منهما على قناة الأيونات مفتوحة ويسمح بامتصاص السوائل.
الالتحام الجزيئي للإندول والإندول المهلجنة بـ GluCL. اتجاهات ارتباط ربيطات (أ) الإندول، (ب) 4-فلوروإندول، (ج) 7-يودوإندول، و(د) 5-يودوإندول بالموقع النشط لـ GluCL. يُمثل البروتين بشريط، وتُعرض الروابط الهيدروجينية الأساسية كخطوط صفراء منقطة. تُظهر (أ')، (ب')، (ج')، و(د') تفاعلات الربيطات المقابلة مع بقايا الأحماض الأمينية المحيطة، وتُشار إلى الروابط الهيدروجينية في السلسلة الجانبية بأسهم وردية منقطة.
أُجريت تجارب لتقييم التأثير السام لمادة 5-يودو إندول على إنبات بذور الكرنب والفجل. كان تأثير 5-يودو إندول (0.05 أو 0.1 ملي مولار) أو أفيرميكتين (10 ميكروغرام/مل) ضئيلاً أو معدوماً على الإنبات الأولي وظهور الشتلات (الشكل 7). بالإضافة إلى ذلك، لم يُعثر على فرق كبير بين معدل إنبات البذور غير المعالجة والبذور المعالجة بـ 5-يودو إندول أو أفيرميكتين. كان التأثير على استطالة الجذر الرئيسي وعدد الجذور الجانبية المتكونة ضئيلاً، على الرغم من أن تركيز 1 ملي مولار (10 أضعاف تركيزه النشط) من 5-يودو إندول قد أبطأ نمو الجذور الجانبية قليلاً. تشير هذه النتائج إلى أن 5-يودو إندول غير سام لخلايا النبات ولا يتداخل مع عمليات نمو النبات عند التركيزات المدروسة.
تأثير 5-يودو إندول على إنبات البذور. إنبات وتنبيت وتجذير جانبي لبذور B. oleracea وR. raphanistrum على وسطي أجار موراشيج وسكوج، مع أو بدون أفيرمكتين أو 5-يودو إندول. سُجِّل الإنبات بعد 3 أيام من الحضانة عند درجة حرارة 22 درجة مئوية.
تُشير هذه الدراسة إلى عدة حالات قتل للديدان الخيطية بواسطة الإندولات. والأهم من ذلك، أن هذا أول تقرير يُظهر أن اليودوإندول يُحفز عملية الميثلة (وهي عملية ناتجة عن تراكم فجوات صغيرة تندمج تدريجيًا لتُشكل فجوات عملاقة، مما يؤدي في النهاية إلى تمزق الغشاء وموته) في إبر الصنوبر، حيث يُظهر اليودوإندول خصائص قاتلة للديدان الخيطية تُشبه خصائص مبيد النيماتودا التجاري أفيرميكتين.
سبق أن أُشير إلى أن الإندولات تُمارس وظائف إشارية متعددة في بدائيات النوى وحقيقيات النوى، بما في ذلك تثبيط/تكوين الأغشية الحيوية، وبقاء البكتيريا، والقدرة على التسبب في الأمراض19،32،33،34. وفي الآونة الأخيرة، استقطبت التأثيرات العلاجية المحتملة للإندولات المهلجنة، وقلويدات الإندول، ومشتقات الإندول شبه الاصطناعية، اهتمامًا بحثيًا واسعًا35،36،37. على سبيل المثال، ثبت أن الإندولات المهلجنة تقتل خلايا الإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية الدائمة37. بالإضافة إلى ذلك، من المهم علميًا دراسة فعالية الإندولات المهلجنة ضد الأنواع والأجناس والممالك الأخرى، وهذه الدراسة تُمثل خطوة نحو تحقيق هذا الهدف.
نقترح هنا آليةً للموت المُستحثّ بـ 5-يودو إندول في الديدان الأسطوانية الرشيقة، استنادًا إلى إصابة الخلايا القابلة للعكس (RCI) والمثيلة (الشكلان 4ج و5). تُعدّ التغيرات الوذمية، مثل الانتفاخ وتنكس الفجوات، مؤشراتٍ على إصابة الخلايا القابلة للعكس والمثيلة، وتتجلى على شكل فجوات عملاقة في السيتوبلازم48،49. يتداخل RCI مع إنتاج الطاقة عن طريق تقليل إنتاج ATP، مما يُسبب فشل مضخة ATPase، أو خللًا في أغشية الخلايا، مُسبّبًا تدفقًا سريعًا لأيونات الصوديوم والكالسيوم والماء50،51،52. تنشأ الفجوات داخل السيتوبلازم في الخلايا الحيوانية نتيجةً لتراكم السوائل في السيتوبلازم بسبب تدفق أيونات الكالسيوم والماء53. ومن المثير للاهتمام أن آلية تلف الخلايا هذه قابلة للعكس إذا كان الضرر مؤقتًا وبدأت الخلايا في إنتاج ATP لفترة زمنية معينة، ولكن إذا استمر الضرر أو ساء، تموت الخلايا.54 تظهر ملاحظاتنا أن الديدان الخيطية المعالجة بـ 5-يودوإندول غير قادرة على استعادة التخليق الحيوي الطبيعي بعد التعرض لظروف الإجهاد.
قد يُعزى نمط الميثيل المُحفَّز بواسطة 5-يودوإندول في بكتيريا العصوية الزائفة الزائفة إلى وجود اليود وتوزيعه الجزيئي، إذ كان لـ 7-يودوإندول تأثير تثبيطي أقل على بكتيريا العصوية الزائفة الزائفة مقارنةً بـ 5-يودوإندول (الجدول 1 والشكل التكميلي S6). تتوافق هذه النتائج جزئيًا مع دراسات مالطيز وآخرون (2014)، الذين أفادوا بأن انتقال جزء نيتروجين البيريديل في الإندول من الموضع شبه- إلى الموضع الميتا- أدى إلى إلغاء تكوُّن الفجوات، وتثبيط النمو، والسمية الخلوية في خلايا U251، مما يشير إلى أن تفاعل الجزيء مع موقع نشط محدد في البروتين أمر بالغ الأهمية27،44،45. كما تدعم التفاعلات بين الإندول أو الإندولات المهلجنة ومستقبلات GluCL التي لوحظت في هذه الدراسة هذه الفكرة، حيث وُجد أن 5-يودوإندول و2-يودوإندول يرتبطان بمستقبلات GluCL بقوة أكبر من الإندولات الأخرى المدروسة (الشكل 6 والشكل التكميلي S8). وُجد أن اليود في الموضع الثاني أو الخامس للإندول يرتبط بالليوسين 218 لمستقبل GluCL عبر روابط هيدروجينية أساسية، بينما تُشكل الإندولات المهلجنة الأخرى والإندول نفسه روابط هيدروجينية ضعيفة في السلسلة الجانبية مع السيرين 260 (الشكل 6). لذلك، نتكهن بأن موضع الهالوجين يلعب دورًا مهمًا في تحريض انحلال الفجوات، بينما يُبقي الارتباط القوي لـ 5-يودوإندول قناة الأيونات مفتوحة، مما يسمح بتدفق سريع للسوائل وتمزق الفجوات. ومع ذلك، لا تزال آلية عمل 5-يودوإندول التفصيلية بحاجة إلى تحديد.
قبل التطبيق العملي لـ 5-يودو إندول، ينبغي تحليل تأثيره السام على النباتات. أظهرت تجاربنا على إنبات البذور عدم وجود أي تأثير سلبي لـ 5-يودو إندول على إنبات البذور أو عمليات النمو اللاحقة عند التركيزات المدروسة (الشكل 7). وبالتالي، تُوفر هذه الدراسة أساسًا لاستخدام 5-يودو إندول في البيئة البيئية للحد من ضرر ديدان الصنوبر الخيطية على أشجار الصنوبر.
أظهرت تقارير سابقة أن العلاج القائم على الإندول يُمثل نهجًا محتملًا لمعالجة مشكلة مقاومة المضادات الحيوية وتطور السرطان55. إضافةً إلى ذلك، تمتلك الإندولات خصائص مضادة للبكتيريا، والسرطان، ومضادات الأكسدة، والالتهابات، ومضادات السكري، والفيروسات، ومضادات التكاثر، ومضادات السل، وقد تُشكل أساسًا واعدًا لتطوير الأدوية56،57. تُشير هذه الدراسة لأول مرة إلى إمكانية استخدام اليود كعامل مضاد للطفيليات والديدان.
اكتُشف الأفيرمكتين قبل ثلاثة عقود، وحصل على جائزة نوبل عام ٢٠١٥، ولا يزال استخدامه كمضاد للديدان جاريًا. ومع ذلك، نظرًا للتطور السريع لمقاومة الأفيرمكتين في الديدان الخيطية والآفات الحشرية، تبرز الحاجة إلى استراتيجية بديلة منخفضة التكلفة وصديقة للبيئة للسيطرة على عدوى نيماتودا الصنوبر في أشجار الصنوبر. كما توضح هذه الدراسة الآلية التي يقضي بها 5-يودو إندول على ديدان الصنوبر الخيطية، وأن 5-يودو إندول يتميز بانخفاض سميته للخلايا النباتية، مما يفتح آفاقًا واعدة لتطبيقاته التجارية المستقبلية.
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة يونغنام، جيونجسان، كوريا، وتم تنفيذ الأساليب وفقًا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات بجامعة يونغنام.
أُجريت تجارب حضانة البيض باستخدام الإجراءات المعمول بها43. ولتقييم معدلات الفقس (HR)، نُقلت ديدان خيطية بالغة عمرها يوم واحد (حوالي 100 أنثى و100 ذكر) إلى أطباق بتري تحتوي على الفطر وتركت لتنمو لمدة 24 ساعة. ثم عُزلت البيضات وعولجت بـ 5-يودوإندول (0.05 ملي مولار و0.1 ملي مولار) أو أفيرميكتين (10 ميكروغرام/مل) كمعلق في ماء مقطر معقم. نُقلت هذه المعلقات (500 ميكرولتر؛ حوالي 100 بيضة) إلى آبار طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئرًا وحُضنت عند درجة حرارة 22 درجة مئوية. أُجريت عدّات L2 بعد 24 ساعة من الحضانة، لكنها اعتُبرت ميتة إذا لم تتحرك الخلايا عند تحفيزها بسلك بلاتيني دقيق. أُجريت هذه التجربة على مرحلتين، كل منهما بست تكرارات. جُمعت البيانات من كلتا التجربتين وعُرضت. يتم حساب نسبة الموارد البشرية على النحو التالي:
تم تقييم معدل وفيات اليرقات باستخدام إجراءات تم تطويرها مسبقًا. تم جمع بيض النيماتودا وتزامن الأجنة عن طريق الفقس في الماء المقطر المعقم لتوليد يرقات المرحلة L2. عولجت اليرقات المتزامنة (حوالي 500 دودة خيطية) بـ 5-يودوإندول (0.05 ملي مولار و 0.1 ملي مولار) أو أفيرميكتين (10 ميكروغرام / مل) ورُبيت على أطباق بتري B. cinerea. بعد 48 ساعة من الحضانة عند 22 درجة مئوية، تم جمع الديدان الخيطية في الماء المقطر المعقم وفحصها بحثًا عن وجود المراحل L2 و L3 و L4. أشار وجود المراحل L3 و L4 إلى تحول اليرقات، بينما أشار وجود المرحلة L2 إلى عدم وجود تحول. تم الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير الخلوي الرقمي iRiS™. أجريت هذه التجربة على مرحلتين، كل منهما بستة تكرارات. تم دمج البيانات من كلتا التجربتين وعرضها.
تم تقييم سمية 5-يودوإندول وأفيرمكتين للبذور باستخدام اختبارات الإنبات على أطباق أجار موراشيج وسكوج.62 نُقعت بذور B. oleracea وR. raphanistrum أولاً في ماء مقطر معقم لمدة يوم واحد، ثم غُسلت بـ 1 مل من الإيثانول بنسبة 100%، وعُقّمت بـ 1 مل من مبيض تجاري بنسبة 50% (3% هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 15 دقيقة، وغُسلت خمس مرات بـ 1 مل من الماء المعقم. ثم كُبست البذور المعقمة على أطباق أجار الإنبات التي تحتوي على 0.86 جم/لتر (0.2X) من وسط موراشيج وسكوج و0.7% من الأجار البكتريولوجي مع أو بدون 5-يودوإندول أو أفيرمكتين. ثم حُضّنت الأطباق عند درجة حرارة 22 درجة مئوية، والتُقطت الصور بعد 3 أيام من الحضانة. أُجريت هذه التجربة على مرحلتين، تكررت كل منهما ست مرات.