تقييم اليود والأفيرمكتين كمحفزات لمرض الديدان الخيطية في أشجار الصنوبر

تُعدّ دودة الصنوبر الخيطية طفيليًا داخليًا مهاجرًا خاضعًا للحجر الصحي، ومعروفًا بتسببه في خسائر اقتصادية فادحة في النظم البيئية لغابات الصنوبر. تستعرض هذه الدراسة فعالية مركبات الإندول المهلجنة كمبيدات للديدان الخيطية ضد ديدان الصنوبر الخيطية وآلية عملها. وقد تشابهت فعالية 5-يودوإندول وأفيرمكتين (كعنصر تحكم إيجابي) كمبيدات للديدان الخيطية ضد ديدان الصنوبر الخيطية، وكانت عالية حتى عند التركيزات المنخفضة (10 ميكروغرام/مل). قلّل 5-يودوإندول من الخصوبة، والنشاط التناسلي، ومعدل وفيات الأجنة واليرقات، والسلوك الحركي. تدعم التفاعلات الجزيئية للروابط مع مستقبلات قنوات الكلوريد المُفعّلة بالغلوتامات الخاصة باللافقاريات فكرة أن 5-يودوإندول، مثل أفيرمكتين، يرتبط بقوة بالموقع النشط للمستقبل. أدى مركب 5-يودوإندول أيضًا إلى تشوهات ظاهرية متنوعة في الديدان الخيطية، بما في ذلك انهيار/انكماش غير طبيعي للأعضاء وزيادة في تكوين الفجوات. تشير هذه النتائج إلى أن الفجوات قد تلعب دورًا في موت الديدان الخيطية الناتج عن مثيلة الحمض النووي. ومن الجدير بالذكر أن مركب 5-يودوإندول لم يكن سامًا لكلا نوعي النبات (الكرنب والفجل). وبذلك، تُظهر هذه الدراسة أن استخدام اليودوإندول في الظروف البيئية يُمكن أن يُسيطر على أضرار ذبول الصنوبر.
تنتمي دودة خشب الصنوبر (Bursaphelenchus xylophilus) إلى فصيلة ديدان خشب الصنوبر (PWN)، وهي ديدان طفيلية داخلية مهاجرة معروفة بتسببها في أضرار بيئية جسيمة لأنظمة غابات الصنوبر.¹ ويُعدّ مرض ذبول الصنوبر (PWD) الناجم عن هذه الدودة مشكلة خطيرة في العديد من القارات، بما في ذلك آسيا وأوروبا، وفي أمريكا الشمالية، حيث تُدمّر هذه الدودة أنواع الصنوبر الدخيلة.^1،2 ويُمثّل تدهور أشجار الصنوبر مشكلة اقتصادية رئيسية، كما أن احتمالية انتشاره عالميًا تُثير القلق.³ وتُعدّ الأنواع التالية من الصنوبر الأكثر عرضة للإصابة بهذه الدودة: الصنوبر الأحمر (Pinus densiflora)، والصنوبر البري (Pinus sylvestris)، والصنوبر الياباني (Pinus thunbergii)، والصنوبر الكوري (Pinus koraiensis)، والصنوبر الياباني (Pinus thunbergii)، والصنوبر المشع (Pinus radiata).⁴ وتُعتبر دودة خشب الصنوبر مرضًا خطيرًا يُمكن أن يُؤدي إلى موت أشجار الصنوبر في غضون أسابيع أو أشهر من الإصابة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تفشي الديدان الخيطية الصنوبرية شائع في مجموعة متنوعة من النظم البيئية، لذلك تم إنشاء سلاسل عدوى مستمرة1.
دودة بورسافيلينكوس زيلوفيلوس هي دودة طفيلية نباتية خاضعة للحجر الصحي، تنتمي إلى فوق عائلة أفيلينكويديا والفرع 102.5. تتغذى هذه الدودة على الفطريات وتتكاثر في أنسجة خشب أشجار الصنوبر، حيث تمر بأربع مراحل يرقية مختلفة: L1، L2، L3، L4، ثم تصل إلى مرحلة البلوغ.^1,6 في ظروف نقص الغذاء، تنتقل دودة الصنوبر إلى مرحلة يرقية متخصصة تُسمى مرحلة السكون (dauer)، حيث تتطفل على ناقلها - خنفساء لحاء الصنوبر (Monochamus alternatus) - وتنتقل إلى أشجار الصنوبر السليمة. في العوائل السليمة، تهاجر الديدان بسرعة عبر أنسجة النبات وتتغذى على الخلايا البرنشيمية، مما يؤدي إلى عدد من تفاعلات فرط الحساسية، وذبول الصنوبر، وموته في غضون عام من الإصابة.^1,7,8
لطالما شكلت المكافحة البيولوجية لديدان الصنوبر تحديًا كبيرًا، حيث تعود إجراءات الحجر الصحي إلى القرن العشرين. وتعتمد الاستراتيجيات الحالية لمكافحة هذه الديدان بشكل أساسي على المعالجات الكيميائية، بما في ذلك تبخير الأخشاب وزرع مبيدات الديدان في جذوع الأشجار. ومن أكثر مبيدات الديدان استخدامًا الأفرمكتين وبنزوات الأفرمكتين، وهما ينتميان إلى عائلة الأفرمكتين. هذه المواد الكيميائية باهظة الثمن وفعالة للغاية ضد العديد من أنواع الديدان، وتُعتبر آمنة بيئيًا. ومع ذلك، من المتوقع أن يؤدي الاستخدام المتكرر لهذه المبيدات إلى ضغط انتقائي سيؤدي حتمًا إلى ظهور ديدان صنوبر مقاومة، كما هو الحال مع العديد من الآفات الحشرية، مثل دودة خضرة الصنوبر (Leptinotarsa ​​decemlineata) ودودة الملفوف (Plutella xylostella) والديدان الأسطوانية (Trichostrongylus colubriformis) ودودة الصنوبر (Ostertagia circumcincta)، التي طورت تدريجيًا مقاومة للأفرمكتين. لذا، من الضروري دراسة أنماط المقاومة بانتظام وفحص مبيدات النيماتودا باستمرار لإيجاد تدابير بديلة وفعالة من حيث التكلفة وصديقة للبيئة لمكافحة مرض تعفن الجذور. في العقود الأخيرة، اقترح عدد من الباحثين استخدام مستخلصات نباتية وزيوت عطرية ومركبات متطايرة كعوامل لمكافحة النيماتودا.
لقد أثبتنا مؤخرًا فعالية الإندول، وهو جزيء إشاري بين الخلايا وبين الممالك الحيوية، كمبيد للديدان الخيطية في دودة Caenorhabditis elegans¹⁷. يُعد الإندول إشارة داخلية واسعة الانتشار في البيئة الميكروبية، حيث يتحكم في العديد من الوظائف التي تؤثر على فسيولوجيا الميكروبات، وتكوين الأبواغ، واستقرار البلازميدات، ومقاومة الأدوية، وتكوين الأغشية الحيوية، والضراوة^{18، 19}. لم تُدرس فعالية الإندول ومشتقاته ضد أنواع أخرى من الديدان الخيطية الممرضة. في هذه الدراسة، بحثنا فعالية 34 نوعًا من الإندول كمبيد للديدان الخيطية ضد ديدان الصنوبر، وكشفنا آلية عمل أقوى هذه الأنواع، وهو 5-يودوإندول، باستخدام المجهر، والتصوير الفوتوغرافي المتعاقب، وتجارب المحاكاة الجزيئية، وقيمنا آثاره السامة على النباتات باستخدام اختبار إنبات البذور.
أُفيد سابقًا أن التركيزات العالية من الإندول (>1.0 ملي مولار) لها تأثير مبيد للديدان الخيطية¹⁷. بعد معالجة ديدان B. xylophilus (في مراحل نموها المختلفة) بالإندول أو 33 مشتقًا مختلفًا منه بتركيز 1 ملي مولار، قُيس معدل نفوق الديدان الخيطية عن طريق عدّ الديدان الحية والميتة في مجموعتي التحكم والمعالجة. أظهرت خمسة أنواع من الإندول نشاطًا مبيدًا للديدان الخيطية بشكل ملحوظ؛ إذ بلغت نسبة بقاء مجموعة التحكم غير المعالجة 95 ± 7% بعد 24 ساعة. من بين 34 نوعًا من الإندول التي تم اختبارها، تسبب كل من 5-يودوإندول و4-فلوروإندول بتركيز 1 ملي مولار في نفوق جميع الديدان، بينما تسبب كل من 5،6-ثنائي فلوروإنديجو، وميثيل إندول-7-كربوكسيلات، و7-يودوإندول في نفوق ما يقارب 50% (الجدول 1).
تأثير 5-يودوإندول على تكوين الفجوات واستقلاب دودة خشب الصنوبر. (أ) تأثير الأفرمكتين و5-يودوإندول على ذكور الديدان البالغة، (ب) بيض الديدان في المرحلة اليرقية الأولى (L1)، و(ج) استقلاب دودة خشب الصنوبر (B. xylophilus). (1) لم تُلاحظ فجوات عند الساعة 0، وأدى العلاج إلى: (2) ظهور فجوات، (3) تراكم فجوات متعددة، (4) انتفاخ الفجوات، (5) اندماج الفجوات، و(6) تكوين فجوات عملاقة. تشير الأسهم الحمراء إلى انتفاخ الفجوات، وتشير الأسهم الزرقاء إلى اندماج الفجوات، وتشير الأسهم السوداء إلى الفجوات العملاقة. مقياس الرسم = 50 ميكرومتر.
بالإضافة إلى ذلك، وصفت هذه الدراسة أيضًا العملية المتسلسلة للموت الناجم عن الميثان في ديدان الصنوبر الخيطية (الشكل 4ج). يُعد الموت الميثاني نوعًا من موت الخلايا غير الاستماتية، ويرتبط بتراكم فجوات سيتوبلازمية بارزة²⁷. ويبدو أن العيوب المورفولوجية الملاحظة في ديدان الصنوبر الخيطية مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بآلية الموت الناجم عن الميثان. أظهر الفحص المجهري في أوقات مختلفة تكوّن فجوات عملاقة بعد 20 ساعة من التعرض لـ 5-يودوإندول (0.1 ملي مولار). لوحظت فجوات مجهرية بعد 8 ساعات من المعالجة، وازداد عددها بعد 12 ساعة. كما لوحظت عدة فجوات كبيرة بعد 14 ساعة. وكانت عدة فجوات مندمجة مرئية بوضوح بعد 12-16 ساعة من المعالجة، مما يشير إلى أن اندماج الفجوات هو أساس آلية الموت الميثاني. بعد 20 ساعة، وُجدت عدة فجوات عملاقة في جميع أنحاء الدودة. تمثل هذه الملاحظات أول تقرير عن الانقسام الخلوي في دودة C. elegans.
في الديدان المعالجة بـ 5-يودوإندول، لوحظ أيضًا تجمع الفجوات وتمزقها (الشكل 5)، كما يتضح من انحناء الدودة وانطلاق الفجوات إلى البيئة المحيطة. كما لوحظ تمزق الفجوات في غشاء قشرة البيضة، الذي عادةً ما يبقى سليمًا في الطور اليرقي الثاني (L2) أثناء الفقس (الشكل التكميلي S2). تدعم هذه الملاحظات دور تراكم السوائل وفشل التنظيم الأسموزي، بالإضافة إلى تلف الخلايا القابل للعكس، في عملية تكوين الفجوات وتقيحها (الشكل 5).
انطلاقًا من فرضية دور اليود في تكوين الفجوات الملحوظ، درسنا فعالية يوديد الصوديوم (NaI) ويوديد البوتاسيوم (KI) كمبيد للديدان الخيطية. مع ذلك، لم تؤثر هذه المواد، عند تركيزات (0.1، 0.5، أو 1 ملي مولار)، على بقاء الديدان الخيطية أو تكوين الفجوات (الشكل التكميلي S5)، على الرغم من أن تركيز 1 ملي مولار من يوديد البوتاسيوم أظهر تأثيرًا طفيفًا كمبيد للديدان الخيطية. من جهة أخرى، حثّ 7-يودوإندول (بتركيز 1 أو 2 ملي مولار)، مثل 5-يودوإندول، على تكوين فجوات متعددة وتشوهات بنيوية (الشكل التكميلي S6). أظهر اليودوإندولان خصائص ظاهرية متشابهة في ديدان الصنوبر الخيطية، بينما لم يُظهر يوديد الصوديوم ويوديد البوتاسيوم أي تأثير مماثل. ومن المثير للاهتمام أن الإندول لم يحفز تكوين الفجوات في دودة الصنوبر B. xylophilus عند التركيزات المختبرة (البيانات غير معروضة). وهكذا، أكدت النتائج أن مركب الإندول واليود مسؤول عن تكوين الفجوات واستقلاب B. xylophilus.
من بين الإندولات التي تم اختبارها لفعاليتها كمبيدات للديدان الخيطية، سجل 5-يودوإندول أعلى مؤشر انزلاق بلغ -5.89 كيلو كالوري/مول، يليه 7-يودوإندول (-4.48 كيلو كالوري/مول)، ثم 4-فلوروإندول (-4.33)، وأخيرًا الإندول (-4.03) (الشكل 6). يُعزى استقرار ارتباط 5-يودوإندول بالليوسين 218 إلى الروابط الهيدروجينية القوية في هيكله الأساسي، بينما ترتبط جميع مشتقات الإندول الأخرى بالسيرين 260 عبر روابط هيدروجينية في السلاسل الجانبية. من بين مركبات اليودوإندول الأخرى التي تم نمذجتها، يمتلك 2-يودوإندول قيمة ارتباط تبلغ -5.248 كيلو كالوري/مول، ويرجع ذلك إلى رابطة الهيدروجين الرئيسية مع الليوسين 218. وتشمل الارتباطات المعروفة الأخرى 3-يودوإندول (-4.3 كيلو كالوري/مول)، و4-يودوإندول (-4.0 كيلو كالوري/مول)، و6-فلوروإندول (-2.6 كيلو كالوري/مول) (الشكل التكميلي S8). معظم الإندولات المهلجنة والإندول نفسه، باستثناء 5-يودوإندول و2-يودوإندول، تُشكّل رابطة مع السيرين 260. ويؤكد تكوين الرابطة الهيدروجينية مع الليوسين 218، الذي يُعد مؤشرًا على كفاءة ارتباط المستقبل بالرابط، كما لوحظ بالنسبة للإيفرمكتين (الشكل التكميلي S7)، أن 5-يودوإندول و2-يودوإندول، مثل الإيفرمكتين، يرتبطان بقوة بالموقع النشط لمستقبل GluCL عبر الليوسين 218 (الشكل 6 والشكل التكميلي S8). نقترح أن هذا الارتباط ضروري للحفاظ على بنية المسام المفتوحة لمركب GluCL، وأن ارتباط 5-يودوإندول و2-يودوإندول والأفرمكتين والإيفرمكتين بقوة بالموقع النشط لمستقبل GluCL يُبقي قناة الأيونات مفتوحة، مما يسمح بامتصاص السوائل.
الالتحام الجزيئي للإندول والإندول المهلجن مع إنزيم GluCL. اتجاهات ارتباط (أ) الإندول، (ب) 4-فلوروإندول، (ج) 7-يودوإندول، و(د) 5-يودوإندول مع الموقع النشط لإنزيم GluCL. يُمثَّل البروتين بشريط، وتُظهر الخطوط المنقطة الصفراء روابط الهيدروجين في هيكله الأساسي. تُظهر (أ′)، (ب′)، (ج′)، و(د′) تفاعلات الروابط المقابلة مع بقايا الأحماض الأمينية المحيطة، وتُشير الأسهم المنقطة الوردية إلى روابط الهيدروجين في السلاسل الجانبية.
أُجريت تجارب لتقييم التأثير السام لمركب 5-يودوإندول على إنبات بذور الملفوف والفجل. لم يُظهر مركب 5-يودوإندول (بتركيز 0.05 أو 0.1 ملي مولار) أو الأفرمكتين (بتركيز 10 ميكروغرام/مل) تأثيرًا يُذكر على الإنبات الأولي وظهور الشتلات (الشكل 7). إضافةً إلى ذلك، لم يُلاحظ فرقٌ يُعتد به إحصائيًا بين معدل إنبات البذور غير المعالجة والبذور المعالجة بمركب 5-يودوإندول أو الأفرمكتين. كان التأثير على استطالة الجذر الرئيسي وعدد الجذور الجانبية المتكونة ضئيلاً، على الرغم من أن تركيز 1 ملي مولار (أي عشرة أضعاف تركيزه الفعال) من مركب 5-يودوإندول أدى إلى تأخير طفيف في نمو الجذور الجانبية. تشير هذه النتائج إلى أن مركب 5-يودوإندول غير سام للخلايا النباتية ولا يُعيق عمليات نمو النبات بالتركيزات المدروسة.
تأثير 5-يودوإندول على إنبات البذور. تم قياس إنبات بذور الكرنب (Brassica oleracea) واللفت (R. raphanistrum) ونموها الجانبي وتكوين جذورها على وسط موراشيغ وسكوج الآغاري، مع أو بدون إضافة أفيرمكتين أو 5-يودوإندول. سُجل الإنبات بعد 3 أيام من الحضانة عند درجة حرارة 22 درجة مئوية.
تُوثّق هذه الدراسة عدة حالات لقتل الديدان الخيطية بواسطة الإندولات. والأهم من ذلك، أن هذا هو التقرير الأول عن تحفيز اليودوإندول لعملية المثيلة (وهي عملية ناتجة عن تراكم فجوات صغيرة تندمج تدريجيًا لتكوين فجوات عملاقة، مما يؤدي في النهاية إلى تمزق الغشاء وموت الديدان) في إبر الصنوبر، حيث أظهر اليودوإندول خصائص مبيدة للديدان الخيطية مماثلة لتلك الخاصة بمبيد الديدان الخيطية التجاري أفيرمكتين.
سبق أن أشارت الدراسات إلى أن الإندولات تؤدي وظائف إشارات متعددة في بدائيات النوى وحقيقيات النوى، بما في ذلك تثبيط/تكوين الأغشية الحيوية، وبقاء البكتيريا، وإمراضيتها^{19،32،33،34}. ومؤخرًا، استقطبت التأثيرات العلاجية المحتملة للإندولات المهلجنة، وقلويدات الإندول، ومشتقات الإندول شبه الاصطناعية اهتمامًا بحثيًا واسعًا^35،36،37. فعلى سبيل المثال، ثبت أن الإندولات المهلجنة تقضي على خلايا الإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية المقاومة³⁷. إضافةً إلى ذلك، من المهم علميًا دراسة فعالية الإندولات المهلجنة ضد أنواع وأجناس وممالك أخرى، وتُعد هذه الدراسة خطوة نحو تحقيق هذا الهدف.
نقترح هنا آليةً لسمية دودة C. elegans بفعل 5-يودوإندول، تعتمد على تلف الخلايا العكوس (RCI) والمثيلة (الشكلان 4C و5). تُعدّ التغيرات الوذمية، كالتورم وتدهور الفجوات، مؤشراتٍ على تلف الخلايا العكوس والمثيلة، والتي تتجلى في صورة فجوات عملاقة في السيتوبلازم^48،49. يُعيق تلف الخلايا العكوس إنتاج الطاقة عن طريق تقليل إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، أو التسبب في تعطل مضخة الأدينوسين ثلاثي الفوسفاتاز (ATPase)، أو إتلاف أغشية الخلايا، مما يؤدي إلى تدفق سريع لأيونات الصوديوم (Na⁺) والكالسيوم (Ca²⁺) والماء^50،51،52. تنشأ الفجوات داخل السيتوبلازم في الخلايا الحيوانية نتيجةً لتراكم السوائل في السيتوبلازم بسبب تدفق أيونات الكالسيوم والماء⁵³. ومن المثير للاهتمام أن آلية تلف الخلايا هذه قابلة للعكس إذا كان التلف مؤقتًا وبدأت الخلايا في إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) لفترة زمنية معينة، ولكن إذا استمر التلف أو تفاقم، فإن الخلايا تموت.⁵⁴ تُظهر ملاحظاتنا أن الديدان الخيطية المعالجة بـ 5-يودوإندول غير قادرة على استعادة التخليق الحيوي الطبيعي بعد التعرض لظروف الإجهاد.
قد يعود النمط الظاهري للمثيلة الذي يحفزه 5-يودوإندول في بكتيريا B. xylophilus إلى وجود اليود وتوزيعه الجزيئي، إذ كان تأثير 7-يودوإندول المثبط على B. xylophilus أقل من تأثير 5-يودوإندول (الجدول 1 والشكل التكميلي S6). تتوافق هذه النتائج جزئيًا مع دراسات مالطيز وآخرون (2014)، الذين أفادوا بأن انتقال مجموعة نيتروجين البيريديل في الإندول من الوضع بارا إلى الوضع ميتا أدى إلى إزالة التكوّن الفجوي، وتثبيط النمو، والسمية الخلوية في خلايا U251، مما يشير إلى أن تفاعل الجزيء مع موقع نشط محدد في البروتين أمر بالغ الأهمية.^27،44،45 تدعم التفاعلات بين الإندول أو الإندولات المهلجنة ومستقبلات GluCL التي لوحظت في هذه الدراسة هذا المفهوم، حيث وُجد أن 5-يودوإندول و2-يودوإندول يرتبطان بمستقبلات GluCL بقوة أكبر من الإندولات الأخرى التي تم فحصها (الشكل 6 والشكل التكميلي S8). وُجد أن اليود في الموضع الثاني أو الخامس من الإندول يرتبط بالليوسين 218 في مستقبل GluCL عبر روابط هيدروجينية في السلسلة الرئيسية، بينما تُشكل الإندولات المهلجنة الأخرى والإندول نفسه روابط هيدروجينية ضعيفة في السلسلة الجانبية مع السيرين 260 (الشكل 6). لذلك، نفترض أن تموضع الهالوجين يلعب دورًا هامًا في تحفيز التنكس الفجوي، في حين أن الارتباط القوي لـ 5-يودوإندول يُبقي قناة الأيونات مفتوحة، مما يسمح بتدفق سريع للسوائل وتمزق الفجوة. ومع ذلك، لا تزال آلية عمل 5-يودوإندول بالتفصيل غير معروفة.
قبل التطبيق العملي لمركب 5-يودوإندول، ينبغي تحليل تأثيره السام على النباتات. أظهرت تجاربنا على إنبات البذور أن مركب 5-يودوإندول لم يكن له أي تأثير سلبي على إنبات البذور أو عمليات النمو اللاحقة بالتركيزات المدروسة (الشكل 7). وبذلك، توفر هذه الدراسة أساسًا لاستخدام مركب 5-يودوإندول في البيئة الطبيعية لمكافحة أضرار ديدان الصنوبر الخيطية على أشجار الصنوبر.
أظهرت تقارير سابقة أن العلاج القائم على الإندول يمثل نهجًا واعدًا لمعالجة مشكلة مقاومة المضادات الحيوية وتطور السرطان⁵⁵. إضافةً إلى ذلك، تمتلك الإندولات خصائص مضادة للبكتيريا، ومضادة للسرطان، ومضادة للأكسدة، ومضادة للالتهابات، ومضادة لداء السكري، ومضادة للفيروسات، ومضادة للتكاثر، ومضادة للسل، وقد تُشكل أساسًا واعدًا لتطوير الأدوية^56،57. تشير هذه الدراسة، ولأول مرة، إلى إمكانية استخدام اليود كعامل مضاد للطفيليات والديدان.
اكتُشف الأفرمكتين قبل ثلاثة عقود، وحصل على جائزة نوبل عام ٢٠١٥، ولا يزال استخدامه كمضاد للديدان مستمرًا. مع ذلك، ونظرًا للتطور السريع لمقاومة الديدان الخيطية والآفات الحشرية للأفرمكتين، تبرز الحاجة إلى استراتيجية بديلة منخفضة التكلفة وصديقة للبيئة لمكافحة عدوى ديدان الصنوبر الخيطية في أشجار الصنوبر. كما تُبين هذه الدراسة آلية قتل 5-يودوإندول لديدان الصنوبر الخيطية، وتُشير إلى انخفاض سميته للخلايا النباتية، مما يفتح آفاقًا واعدة لتطبيقه التجاري مستقبلًا.
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة يونغنام، غيونغسان، كوريا، وتم تنفيذ الطرق وفقًا لإرشادات لجنة الأخلاقيات بجامعة يونغنام.
أُجريت تجارب حضانة البيض باستخدام إجراءات مُعتمدة⁴³. ولتقييم معدلات الفقس، نُقلت ديدان نيماتودا بالغة عمرها يوم واحد (حوالي 100 أنثى و100 ذكر) إلى أطباق بتري تحتوي على الفطر، وتُركت لتنمو لمدة 24 ساعة. ثم عُزلت البيوض وعُولجت بـ 5-يودوإندول (0.05 ملي مولار و0.1 ملي مولار) أو أفيرمكتين (10 ميكروغرام/مل) على شكل معلق في ماء مقطر معقم. نُقلت هذه المعلقات (500 ميكرولتر؛ حوالي 100 بيضة) إلى آبار صفيحة زراعة الأنسجة ذات 24 بئراً، وحُضنت عند درجة حرارة 22 درجة مئوية. أُجريت عمليات عد اليرقات في المرحلة الثانية (L2) بعد 24 ساعة من التحضين، واعتُبرت ميتة إذا لم تتحرك الخلايا عند تحفيزها بسلك بلاتيني دقيق. أُجريت هذه التجربة على مرحلتين، كل منهما بستة تكرارات. جُمعت البيانات من التجربتين وعُرضت. يتم حساب نسبة معدل ضربات القلب على النحو التالي:
تم تقييم معدل وفيات اليرقات باستخدام إجراءات مطورة سابقًا. جُمعت بيوض الديدان الخيطية، وتمت مزامنة الأجنة عن طريق الفقس في ماء مقطر معقم لإنتاج يرقات في المرحلة الثانية (L2). عُولجت اليرقات المتزامنة (حوالي 500 دودة خيطية) بـ 5-يودوإندول (بتركيز 0.05 ملي مولار و0.1 ملي مولار) أو أفيرمكتين (بتركيز 10 ميكروغرام/مل) ورُبّيت على أطباق بتري تحتوي على فطر Botrytis cinerea. بعد 48 ساعة من الحضانة عند درجة حرارة 22 درجة مئوية، جُمعت الديدان الخيطية في ماء مقطر معقم وفُحصت للكشف عن وجود المراحل L2 وL3 وL4. يشير وجود المرحلتين L3 وL4 إلى تحول اليرقات، بينما يشير وجود المرحلة L2 إلى عدم حدوث تحول. تم الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير الخلوي الرقمي iRiS™. أُجريت هذه التجربة على مرحلتين، كل منهما بستة تكرارات. جُمعت البيانات من التجربتين وعُرضت.
تم تقييم سمية 5-يودوإندول والأفيرمكتين للبذور باستخدام اختبارات الإنبات على أطباق أجار موراشيغ وسكوج.⁶² نُقعت بذور الكرنب (Brassica oleracea) واللفت (R. raphanistrum) أولًا في ماء مقطر معقم لمدة يوم واحد، ثم غُسلت بـ 1 مل من الإيثانول النقي، وعُقمت بـ 1 مل من مبيض تجاري بتركيز 50% (3% هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 15 دقيقة، ثم غُسلت خمس مرات بـ 1 مل من الماء المعقم. بعد ذلك، وُضعت البذور المعقمة على أطباق أجار الإنبات التي تحتوي على 0.86 غ/ل (0.2X) من وسط موراشيغ وسكوج و0.7% من الأجار البكتيري، مع أو بدون 5-يودوإندول أو أفيرمكتين. حُضنت الأطباق عند درجة حرارة 22 درجة مئوية، والتقطت الصور بعد 3 أيام من التحضين. أُجريت هذه التجربة على مرحلتين، كل منهما بستة تكرارات.