اكتشاف وتوصيف وتحسين وظائف أحادي أميدات أورسا كمثبطات نمو نباتية جديدة تؤثر على الأنابيب الدقيقة النباتية.

نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحكم (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون تنسيق أو جافا سكريبت.
يمكن أن يُسهم اكتشاف المنتجات الطبيعية واستخدامها الأمثل في تحسين حياة الإنسان. تُستخدم المواد الكيميائية المثبطة لنمو النباتات على نطاق واسع كمبيدات أعشاب لمكافحة الحشائش الضارة. ونظرًا للحاجة إلى استخدام أنواع مختلفة من مبيدات الأعشاب، تبرز الحاجة إلى تحديد مركبات ذات آليات عمل جديدة. في هذه الدراسة، اكتشفنا مركبًا جديدًا من نوع N-ألكوكسي بيرول، وهو الكوماموناميد، من بكتيريا Streptomyces werraensis MK493-CF1، ووضعنا آلية التخليق الكاملة له. ومن خلال اختبارات النشاط البيولوجي، اكتشفنا أن حمض urs-monoamic هو وسيط تخليقي لمركب urs-monoamide، وله إمكانات واعدة.مثبط نمو النباتبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير مشتقات متنوعة من حمض الأوربينونيك، بما في ذلك مشتق الأوربينيلوكسي (UDA)، الذي يتميز بنشاط مبيد أعشاب عالٍ دون التأثير سلبًا على نمو خلايا هيلا. كما وجدنا أن مشتقات حمض الأورموتونيك تُعطّل الأنيبيبات الدقيقة في النبات؛ علاوة على ذلك، يؤثر مركب KAND على خيوط الأكتين ويُحفّز موت الخلايا. تختلف هذه التأثيرات المتعددة عن تأثيرات مثبطات الأنيبيبات الدقيقة المعروفة، مما يُشير إلى آلية عمل جديدة لحمض الأورسونيك، وهو ما يُمثّل ميزة هامة في تطوير مبيدات أعشاب جديدة.
يُعدّ اكتشاف المنتجات الطبيعية المفيدة ومشتقاتها وتطبيقها العملي وسيلةً لتحسين جودة حياة الإنسان. وقد أدت المستقلبات الثانوية التي تنتجها الكائنات الدقيقة والنباتات والحشرات إلى تحقيق تقدم كبير في الطب والزراعة. كما تم تطوير العديد من المضادات الحيوية وأدوية علاج سرطان الدم من منتجات طبيعية. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير أنواع مختلفة منالمبيدات الحشريةتُستخلص مبيدات الفطريات ومبيدات الأعشاب من هذه المنتجات الطبيعية لاستخدامها في الزراعة. وتُعدّ مبيدات مكافحة الأعشاب الضارة أدواتٍ مهمة لزيادة غلة المحاصيل في الزراعة الحديثة، وتُستخدم أنواعٌ مختلفة من هذه المركبات تجاريًا. وتُعتبر العديد من العمليات الخلوية في النباتات، مثل عملية التمثيل الضوئي، واستقلاب الأحماض الأمينية، وتكوين جدار الخلية، وتنظيم الانقسام الخلوي، وإشارات الهرمونات النباتية، وتخليق البروتين، أهدافًا نموذجية لمبيدات الأعشاب. وتُعدّ المركبات التي تُثبّط وظيفة الأنابيب الدقيقة فئةً شائعة من مبيدات الأعشاب التي تؤثر على نمو النبات من خلال التأثير على تنظيم الانقسام الخلوي.
الأنيبيبات الدقيقة هي مكونات الهيكل الخلوي، وهي محفوظة بشكل واسع في الخلايا حقيقية النواة. يتكون ثنائي التوبولين غير المتجانس من ألفا-توبولين وبيتا-توبولين، مُشكلاً خيوطًا أولية خطية، مع 13 خيطًا أوليًا تُشكل بنية أسطوانية. تؤدي الأنيبيبات الدقيقة أدوارًا متعددة في الخلايا النباتية، بما في ذلك تحديد شكل الخلية، وانقسامها، والنقل داخل الخلايا. تحتوي الخلايا النباتية على أنيبيبات دقيقة أسفل غشاء البلازما في الطور البيني، ويُعتقد أن هذه الأنيبيبات الدقيقة القشرية تُنظم ألياف السليلوز الدقيقة من خلال تنظيم مُركبات سينثاز السليلوز. تقع الأنيبيبات الدقيقة القشرية لخلايا بشرة الجذر، الموجودة في منطقة الاستطالة السريعة لطرف الجذر، بشكل جانبي، وتتبع ألياف السليلوز الدقيقة هذه الأنيبيبات الدقيقة، مُحددةً اتجاه تمدد الخلية، وبالتالي تُعزز استطالة الخلية غير المتناحية. لذا، ترتبط وظيفة الأنابيب الدقيقة ارتباطًا وثيقًا بتشكل النبات. إذ تُسبب استبدالات الأحماض الأمينية في الجينات المُشفِّرة للتيوبيولين انحرافًا في ترتيب الأنابيب الدقيقة القشرية ونموًا جانبيًا أيمن أو أيسر في نبات الأرابيدوبسيس 6،7. وبالمثل، قد تؤدي الطفرات في البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة، والتي تُنظِّم ديناميكيتها، إلى تشوه نمو الجذور 8،9،10،11،12،13. إضافةً إلى ذلك، يُسبب استخدام مبيدات الأعشاب المُعطِّلة للأنابيب الدقيقة، مثل الديسوبيراميد (المعروف أيضًا باسم البريتيلاتشور)، نموًا جانبيًا أيسرًا للجذور 14. تُشير هذه البيانات إلى أن التنظيم الدقيق لوظيفة الأنابيب الدقيقة أمر بالغ الأهمية لتحديد اتجاه نمو النبات.
تم اكتشاف أنواع مختلفة من مثبطات الأنابيب الدقيقة، وقد أسهمت هذه الأدوية إسهامًا كبيرًا في أبحاث الهيكل الخلوي، فضلًا عن الزراعة والطب. وعلى وجه الخصوص، يمكن للأوريزالين، ومركبات ثنائي نيترو أنيلين، والديسوبيراميد، ومركبات البنزاميد، ونظائرها، تثبيط وظيفة الأنابيب الدقيقة، وبالتالي تثبيط نمو النبات. ولذلك، تُستخدم على نطاق واسع كمبيدات للأعشاب. ومع ذلك، نظرًا لأن الأنابيب الدقيقة تُعدّ مكونًا أساسيًا في الخلايا النباتية والحيوانية، فإن معظم مثبطات الأنابيب الدقيقة سامة لكلا النوعين من الخلايا. لذا، وعلى الرغم من فائدتها المعروفة كمبيدات للأعشاب، فإن عددًا محدودًا فقط من العوامل المضادة للأنابيب الدقيقة يُستخدم للأغراض العملية.
الستربتوميسيس جنس من عائلة الستربتوميسيس، التي تضم بكتيريا هوائية موجبة الغرام خيطية الشكل، وتشتهر بقدرتها على إنتاج طيف واسع من المستقلبات الثانوية. ولذلك، تُعتبر من أهم مصادر المنتجات الطبيعية النشطة بيولوجيًا. في هذه الدراسة، اكتشفنا مركبًا جديدًا يُسمى الكوماموناميد، والذي تم عزله من سلالتي الستربتوميسيس ويراينسيس MK493-CF1 وS. werraensis ISP 5486. وباستخدام التحليل الطيفي والتحليل الطيفي الكامل، تم تحديد بنية الكوماموناميد وهيكله الفريد من نوعه N-ألكوكسي بيرول. كما وُجد أن حمض الأورمونيك، وهو وسيط اصطناعي للأورمونوناميد ومشتقاته، يثبط نمو وإنبات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا، وهو نبات نموذجي شائع. في دراسةٍ للعلاقة بين التركيب والنشاط، وجدنا أن مركبًا مُعدَّلًا في الموضع C9 ليصبح حمض أورسونيك، يُسمى مشتق نونيلوكسي لحمض أورسونيك (KAND)، يُعزز بشكلٍ ملحوظ التأثير المُثبِّط على النمو والإنبات. والجدير بالذكر أن مُثبِّط نمو النبات المُكتشف حديثًا أثَّر أيضًا على نمو التبغ وحشيشة الكبد، ولم يكن سامًا للبكتيريا أو خلايا هيلا. علاوةً على ذلك، تُحفِّز بعض مشتقات حمض الأورموتونيك نمطًا ظاهريًا مُشوَّهًا للجذور، مما يُشير إلى أن هذه المشتقات تُؤثِّر بشكلٍ مباشر أو غير مباشر على الأنيبيبات الدقيقة. وتماشيًا مع هذه الفكرة، تُشير مُلاحظاتنا للأنيبيبات الدقيقة المُوسومة إما بالكيمياء المناعية أو بالبروتينات الفلورية إلى أن مُعالجة KAND تُؤدي إلى تفكك الأنيبيبات الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك، أدت المُعالجة بمشتقات حمض الكوماموتونيك إلى تعطيل خيوط الأكتين الدقيقة. وهكذا، اكتشفنا مُثبِّطًا جديدًا لنمو النبات، تتضمن آلية عمله الفريدة تدمير الهيكل الخلوي.
عُزلت السلالة MK493-CF1 من تربة في حي شيناغاوا، طوكيو. وقد شكّلت هذه السلالة غزلًا فطريًا متفرعًا جيدًا. تم تحديد التسلسل الجزئي لجين الحمض النووي الريبوزي 16S (1422 زوجًا قاعديًا). تُشبه هذه السلالة إلى حد كبير سلالة S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486، 1421/1422 زوجًا قاعديًا، T: سلالة نموذجية، 99.93%). بناءً على هذه النتيجة، تبيّن أن هذه السلالة وثيقة الصلة بالسلالة النموذجية لـ S. werraensis. لذلك، أطلقنا عليها مؤقتًا اسم S. werraensis MK493-CF1. تُنتج سلالة S. werraensis ISP 5486T أيضًا نفس المركبات النشطة بيولوجيًا. ونظرًا لقلة الأبحاث السابقة حول استخلاص المنتجات الطبيعية من هذا الكائن الدقيق، فقد أُجريت المزيد من الأبحاث الكيميائية. بعد زراعة بكتيريا S. werraensis MK493-CF1 على وسط شعير بالتخمر في الحالة الصلبة عند درجة حرارة 30 مئوية لمدة 14 يومًا، تم استخلاص الوسط باستخدام الإيثانول بنسبة 50%. جُفِّف 60 مل من العينة للحصول على 59.5 ملغ من المستخلص الخام. خضع المستخلص الخام لتحليل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء ذي طور عكسي (HPLC) للحصول على N-ميثوكسي-1H-بيرول-2-كربوكساميد (1، المسمى كوماموناميد، 36.0 ملغ). تُشكل الكمية الإجمالية للمركب 1 ما يقارب 60% من المستخلص الخام. لذلك، قررنا دراسة خصائص كوماموناميد 1 بالتفصيل.
الكوماموناميد 1 عبارة عن مسحوق أبيض غير متبلور، وقد أكد تحليل مطياف الكتلة عالي الدقة (HRESIMS) أن صيغته الكيميائية هي C6H8N2O2 (الشكل 1). يتميز جزء البيرول المُستبدل عند ذرة الكربون C2 في هذا المركب بـ δH 6.94 (1H، ثلاثي، J = 2.8، 4.8 هرتز، H-4)، وδH 6.78 (1H، ثنائي، J = 2.5، δH في طيف الرنين النووي المغناطيسي للبروتون: 4.5 هرتز، H-5)، وδH 6.78 (1H، ثنائي، J = 2.5 هرتز، H-6). ويُظهر طيف الرنين النووي المغناطيسي للكربون-13 وجود أربع ذرات كربون sp2. تم التحقق من وجود مجموعة أميد عند ذرة الكربون C2 من خلال ارتباط HMBC من بروتون C-3 إلى ذرة كربون الكربونيل للأميد عند δC 161.1. بالإضافة إلى ذلك، تشير قمم الرنين النووي المغناطيسي للبروتون (1H) والكربون-13 (13C) عند δH 4.10 (3H، S) وδC 68.3 إلى وجود مجموعات N-ميثوكسي في الجزيء. على الرغم من أن الموقع الصحيح لمجموعة الميثوكسي لم يُحدد بعد باستخدام التحليل الطيفي، مثل مطيافية الفرق المحسّنة واختصار أوفرهاوزر النووي (NOEDF)، فقد أصبح N-ميثوكسي-1H-بيرول-2-كربوكساميد أول مركب مرشح.
لتحديد البنية الصحيحة للمركب 1، أُجريَ تخليقٌ كلي (الشكل 2أ). أدى تفاعل 2-أمينوبيريدين 2 المتوفر تجاريًا مع m-CPBA إلى الحصول على N-أكسيد 3 المقابل بكمية وفيرة. بعد إضافة مجموعة أمينو أزيد إلى 2، أُجريَ تفاعل التكثيف الحلقي الموصوف من قِبل أبراموفيتش في البنزين عند 90 درجة مئوية للحصول على 1-هيدروكسي-1H-بيرول-2-كربونيتريل 5 المطلوب (بنسبة 60%، على مرحلتين). 15،16. ثم أدى مثيلة المركب 4 وتحلله مائيًا إلى الحصول على حمض 1-ميثوكسي-1H-بيرول-2-كربوكسيليك (المسمى "حمض كوماتونيك"، 6) بنسبة جيدة (70%، على مرحلتين). أخيرًا، أدى تفاعل الأميد عبر وسيط كلوريد الحمض 6 باستخدام الأمونيا المائية إلى الحصول على أميد كوماموتو 1 بنسبة 98%. كانت جميع البيانات الطيفية للمركب 1 المُصنّع مشابهة للمركب 1 المعزول، لذلك تم تحديد بنية المركب 1؛
التخليق العام وتحليل النشاط البيولوجي للأوربيناميد وحمض الأوربينيك. (أ) التخليق الكلي لأميد كوماموتو. (ب) زُرعت بادرات نبات الرشاد البري كولومبيا (Col) بعمر سبعة أيام على أطباق موراشيغ وسكوج (MS) تحتوي على كوماموناميد 6 أو كوماموناميد 1 بالتركيزات الموضحة. مقياس الرسم = 1 سم.
في البداية، قمنا بتقييم النشاط البيولوجي للأوربيناميد ومشتقاته الوسيطة لقدرتها على تنظيم نمو النبات. أضفنا تراكيز مختلفة من الأورموناميد 1 أو حمض الأورمونيك 6 إلى وسط MS أجار، وزرعنا بادرات نبات رشاد أذن الفأر (Arabidopsis thaliana) على هذا الوسط. أظهرت هذه التجارب أن التركيزات العالية (500 ميكرومولار) من المركب 6 تثبط نمو الجذور (الشكل 2ب). بعد ذلك، قمنا بتحضير مشتقات مختلفة عن طريق استبدال ذرة النيتروجين N1 في المركب 6، وأجرينا دراسات حول العلاقة بين التركيب والنشاط عليها (وُصفت عملية تحضير النظائر في المعلومات الداعمة). زُرعت بادرات نبات رشاد أذن الفأر على وسط يحتوي على 50 ميكرومولار من مشتقات حمض الأورمونيك، وقيس طول الجذور كما هو موضح في الصورة. كما هو موضح في الأشكال 3أ، 3ب، وS1، تحتوي أحماض الكومامو على سلاسل ألكوكسي خطية بأطوال مختلفة (9، 10، 11، 12، و13) أو سلاسل ألكوكسي طويلة (15، 16، و17) في الموضع N1. وقد أظهرت المشتقات تثبيطًا ملحوظًا لنمو الجذور. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن تطبيق 200 ميكرومول من المركبات 10، 11، أو 17 يثبط الإنبات (الشكلان 3ج وS2).
دراسة العلاقة بين بنية ونشاط أميد كوماموتو والمركبات ذات الصلة. (أ) بنية ومخطط تركيب النظائر. (ب) قياس طول جذور الشتلات بعمر 7 أيام المزروعة في وسط MS مع أو بدون 50 ميكرومول من مشتقات كوماموناميد. تشير النجوم إلى وجود فروق دالة إحصائيًا مقارنةً بالمعاملة الوهمية (اختبار t، p < 0.001).< 0.05). ن>١٨. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري. يشير الرمز nt إلى "غير مختبر" لأن أكثر من ٥٠٪ من البذور لم تنبت. (ج) قياس معدل إنبات البذور المعالجة التي حُضنت لمدة ٧ أيام في وسط MS مع أو بدون ٢٠٠ ميكرومول من الكوموناميد والمركبات ذات الصلة. تشير النجوم إلى وجود فروق دالة إحصائيًا مع المعالجة الوهمية (اختبار مربع كاي). ن = ٩٦.
ومن المثير للاهتمام أن إضافة سلاسل جانبية ألكيلية أطول من C9 قللت من النشاط التثبيطي، مما يشير إلى أن المركبات المرتبطة بحمض الكوماموتويك تتطلب سلاسل جانبية ذات حجم معين لإظهار نشاطها البيولوجي.
نظراً لأن تحليل العلاقة بين التركيب والنشاط أظهر أن المركب C9 قد تم تعديله إلى حمض أورسونيك، وأن مشتق نونيلوكسي من حمض أورسونيك (المشار إليه فيما يلي بـ KAND 11) كان أكثر مثبطات نمو النبات فعالية، فقد أجرينا دراسة تفصيلية أكثر لـ KAND 11. أدى علاج نبات الأرابيدوبسيس بتركيز 50 ميكرومولار من KAND 11 إلى منع الإنبات بشكل شبه كامل، بينما أدت التركيزات المنخفضة (40، 30، 20، أو 10 ميكرومولار) من KAND 11 إلى تثبيط نمو الجذور بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 4أ، ب). ولاختبار ما إذا كان KAND 11 يؤثر على حيوية المرستيم الجذري، قمنا بفحص المرستيمات الجذرية المصبوغة ببروبيديوم يوديد (PI) وقمنا بقياس مساحة المرستيم. بلغ حجم النسيج الإنشائي للشتلات النامية في وسط يحتوي على 25 ميكرومول من KAND-11، 151.1 ± 32.5 ميكرومتر، بينما بلغ حجمه في الشتلات النامية في وسط تحكم يحتوي على DMSO، 264.7 ± 30.8 ميكرومتر (الشكل 4ج، د)، مما يشير إلى أن KAND-11 يعيد النشاط الخلوي. وتماشياً مع ذلك، أدى العلاج بـ KAND-11 إلى تقليل كمية إشارة مؤشر انقسام الخلايا CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS في النسيج الإنشائي للجذر (الشكل 4هـ)¹⁷. تشير هذه النتائج إلى أن KAND-11 يثبط نمو الجذر عن طريق تقليل نشاط تكاثر الخلايا.
تحليل التأثير المثبط لمشتقات حمض الأوربينونيك (مشتقات الأوربينيلوكسي) على النمو. (أ) شتلات Col من النوع البري عمرها 7 أيام، مزروعة على أطباق MS مع التركيزات الموضحة من KAND 11. مقياس الرسم = 1 سم. (ب) قياس طول الجذر. تشير الأحرف إلى وجود فروق معنوية (اختبار Tukey HSD، p < 0.05).< 0.05). ن>١٦. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري. (ج) مجهر متحد البؤر لجذور نبات Col من النوع البري المصبوغة ببروبيديوم يوديد، والمُنمّاة على أطباق MS مع أو بدون ٢٥ ميكرومول من KAND ١١. تشير الأقواس البيضاء إلى المرستيم الجذري. مقياس الرسم = ١٠٠ ميكرومتر. (د) قياس حجم المرستيم الجذري (ن = ١٠ إلى ١١). تم تحديد الفروق الإحصائية باستخدام اختبار t (قيمة p < ٠.٠٥).(< 0.05). تمثل الأعمدة متوسط ​​حجم النسيج الإنشائي. (هـ) مجهر التباين التفاضلي التداخلي (DIC) لنسيج إنشائي جذري يحتوي على بنية CDKB2؛ 1pro: CDKB2؛ 1-GUS مصبوغ ومصبوغ على بادرات عمرها 5 أيام مزروعة على أطباق MS مع أو بدون اختبار KAND بتركيز 25 ميكرومتر.
تم اختبار السمية النباتية لمركب KAND 11 باستخدام نبات ثنائي الفلقة آخر، وهو التبغ (Nicotiana tabacum)، وكائن حي نموذجي رئيسي من النباتات البرية، وهو حشيشة الكبد (Marchantia polymorpha). وكما هو الحال في نبات الرشاد، أنتجت شتلات التبغ SR-1 التي نمت في وسط يحتوي على 25 ميكرومول من KAND 11 جذورًا أقصر (الشكل 5أ). بالإضافة إلى ذلك، نبتت 40 بذرة من أصل 48 بذرة على أطباق تحتوي على 200 ميكرومول من KAND 11، بينما نبتت جميع البذور الـ 48 على أوساط غير معالجة، مما يشير إلى أن التركيزات الأعلى من KAND كانت ذات دلالة إحصائية (p < 0.05).أظهرت النتائج (قيمة p < 0.05؛ اختبار مربع كاي) تثبيطًا لإنبات التبغ (الشكل 5ب). بالإضافة إلى ذلك، كان تركيز KAND 11 الذي ثبّط نمو البكتيريا في حشيشة الكبد مشابهًا للتركيز الفعال في نبات الرشاد (الشكل 5ج). تشير هذه النتائج إلى أن KAND 11 قادر على تثبيط نمو مجموعة متنوعة من النباتات. بعد ذلك، درسنا السمية الخلوية المحتملة لمركبات أحادية الأميد الدب في كائنات حية أخرى، وتحديدًا خلايا هيلا البشرية وسلالة الإشريكية القولونية DH5α، كممثلين للخلايا الحيوانية العليا والخلايا البكتيرية على التوالي. في سلسلة من اختبارات تكاثر الخلايا، لاحظنا أن الكوموناميد 1، وحمض الكوموناميديك 6، وKAND 11 لم تؤثر على نمو خلايا هيلا أو الإشريكية القولونية بتركيز 100 ميكرومولار (الشكل 5د، هـ).
تثبيط نمو الكائنات غير الأرابيدوبسيس بواسطة KAND 11. (أ) زُرعت شتلات تبغ SR-1 البرية، بعمر أسبوعين، على أطباق MS عمودية تحتوي على 25 ميكرومول من KAND 11. (ب) زُرعت شتلات تبغ SR-1 البرية، بعمر أسبوعين، على أطباق MS أفقية تحتوي على 200 ميكرومول من KAND 11. (ج) براعم حشيشة الكبد Tak-1 البرية، بعمر أسبوعين، نُمت على أطباق Gamborg B5 مع التراكيز الموضحة من KAND 11. تشير الأسهم الحمراء إلى الأبواغ التي توقف نموها خلال فترة الحضانة التي استمرت أسبوعين. (د) اختبار تكاثر خلايا HeLa. تم قياس عدد الخلايا الحية على فترات زمنية محددة باستخدام مجموعة عد الخلايا 8 (Dojindo). كعنصر تحكم، عولجت خلايا هيلا بـ 5 ميكروغرام/مل من أكتينوميسين د (Act D)، الذي يثبط نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي ويسبب موت الخلايا. أُجريت التحليلات ثلاث مرات. (هـ) اختبار تكاثر خلايا الإشريكية القولونية. تم تحليل نمو الإشريكية القولونية بقياس الامتصاص الضوئي عند 600 نانومتر. كعنصر تحكم، عولجت الخلايا بـ 50 ميكروغرام/مل من أمبيسيلين (Amp)، الذي يثبط تخليق جدار الخلية البكتيرية. أُجريت التحليلات ثلاث مرات.
لفهم آلية عمل السمية الخلوية الناتجة عن مركبات اليوراميد، أعدنا تحليل مشتقات حمض اليوروبينيك ذات التأثيرات المثبطة المتوسطة، كما هو موضح في الصورة. وكما هو مبين في الشكلين 2ب و6أ، أنتجت الشتلات النامية على أطباق أجار تحتوي على تركيزات عالية (200 ميكرومول) من حمض اليوروموتونيك 6 جذورًا أقصر ومنحنية نحو اليسار (θ = -23.7 ± 6.1)، بينما أنتجت الشتلات النامية على وسط التحكم جذورًا مستقيمة تقريبًا (θ = -3.8 ± 7.1). من المعروف أن هذا النمو المائل المميز ينتج عن خلل في الأنيبيبات الدقيقة القشرية^14،18. وتماشيًا مع هذه النتيجة، حثّت الأدوية المزعزعة لاستقرار الأنيبيبات الدقيقة، مثل ديسوبيراميد وأوريزالين، على ميلان مماثل للجذور في ظل ظروف النمو لدينا (الشكلان 2ب و6أ). في الوقت نفسه، اختبرنا مشتقات حمض الأورموتونيك، واخترنا منها عدة مركبات حثّت، عند تراكيز معينة، نموًا مائلًا للجذور. غيّرت المركبات 8 و9 و15 اتجاه نمو الجذور عند تراكيز 75 ميكرومولار و50 ميكرومولار و40 ميكرومولار على التوالي، مما يشير إلى قدرة هذه المركبات على زعزعة استقرار الأنيبيبات الدقيقة بفعالية (الشكل 2ب، 6أ). كما اختبرنا أقوى مشتقات حمض الأورسوليك، KAND 11، بتركيز أقل (15 ميكرومولار)، ووجدنا أن استخدام KAND 11 يثبط نمو الجذور، وأن اتجاه نمو الجذور غير منتظم، مع ميلها نحو اليسار (الشكل C3). ولأن التراكيز العالية من الأدوية المزعزعة لاستقرار الأنيبيبات الدقيقة قد تثبط نمو النبات أحيانًا بدلًا من التسبب في ميلان الجذور، فقد قيّمنا لاحقًا إمكانية تأثير KAND 11 على الأنيبيبات الدقيقة من خلال مراقبة الأنيبيبات الدقيقة القشرية في خلايا البشرة الجذرية. أظهر الفحص المناعي النسيجي باستخدام الأجسام المضادة لبروتين بيتا-توبولين في خلايا البشرة لجذور الشتلات المعالجة بـ 25 ميكرومول من مركب KAND 11 اختفاء جميع الأنيبيبات الدقيقة القشرية تقريبًا في خلايا البشرة بمنطقة الاستطالة (الشكل 6ب). تشير هذه النتائج إلى أن حمض الكوماموتونيك ومشتقاته تعمل بشكل مباشر أو غير مباشر على الأنيبيبات الدقيقة لتعطيلها، وأن هذه المركبات تُعد مثبطات جديدة للأنيبيبات الدقيقة.
يُغير حمض الأورسونيك ومشتقاته الأنيبيبات الدقيقة القشرية في نبات رشاد أذن الفأر (Arabidopsis thaliana). (أ) زاوية ميل الجذر المقاسة في وجود مشتقات مختلفة من حمض الأورموتونيك بالتركيزات الموضحة. كما تم تحليل تأثير مركبين معروفين بتثبيط الأنيبيبات الدقيقة: ديسوبيراميد وأوريزالين. يوضح الشكل المُدرج المعيار المستخدم لقياس زاوية نمو الجذر. تشير النجوم إلى وجود فروق دالة إحصائيًا مقارنةً بالمعالجة الوهمية (اختبار t، p < 0.001).< 0.05). ن>١٩. مقياس الرسم = ١ سم. (ب) الأنيبيبات الدقيقة القشرية في خلايا البشرة في منطقة الاستطالة. تم تصوير الأنيبيبات الدقيقة في جذور نبات أرابيدوبسيس كول البري المزروع على أطباق MS مع أو بدون ٢٥ ميكرومتر من KAND ١١ باستخدام التلوين المناعي النسيجي باستخدام الأجسام المضادة الأولية لبروتين بيتا-توبولين والأجسام المضادة الثانوية المقترنة بـ Alexa Fluor. مقياس الرسم = ١٠ ميكرومتر. (ج) البنية الانقسامية للأنيبيبات الدقيقة في المرستيم الجذري. تم تصوير الأنيبيبات الدقيقة باستخدام التلوين المناعي النسيجي. تم عد البنى الانقسامية، بما في ذلك مناطق الطور التمهيدي والمغازل والفراغموبلاستات، من صور المجهر متحد البؤر. تشير الأسهم إلى بنى الأنيبيبات الدقيقة الانقسامية. تشير النجوم إلى اختلافات معنوية مع المعالجة الوهمية (اختبار t، p < 0.05).< 0.05). ن>9. مقياس الرسم = 50 ميكرومتر.
على الرغم من قدرة أورسا على تعطيل وظيفة الأنيبيبات الدقيقة، يُتوقع أن تكون آلية عملها مختلفة عن عوامل إزالة بلمرة الأنيبيبات الدقيقة التقليدية. فعلى سبيل المثال، تُحفز التركيزات العالية من عوامل إزالة بلمرة الأنيبيبات الدقيقة، مثل ديسوبيراميد وأوريزالين، تمددًا غير متجانس للخلايا البشرية، بينما لا يُحدث KAND 11 هذا التأثير. بالإضافة إلى ذلك، أدى التطبيق المشترك لـ KAND 11 وديسوبيراميد إلى استجابة نمو جذري مُشتركة ناتجة عن ديسوبيراميد، ولوحظ تثبيط النمو الناتج عن KAND 11 (الشكل S4). كما قمنا بتحليل استجابة الطفرة شديدة الحساسية لديسوبيراميد 1-1 (phs1-1) لـ KAND 11. تحتوي phs1-1 على طفرة نقطية غير نمطية في كيناز التوبولين، وتُنتج جذورًا أقصر عند معالجتها بديسوبيراميد. كانت شتلات الطفرة phs1-1 التي نمت على وسط أجار يحتوي على KAND 11 لها جذور أقصر مماثلة لتلك التي نمت على وسط ديسوبيراميد (الشكل S5).
بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا هياكل الأنابيب الدقيقة الانقسامية، مثل مناطق الطور التمهيدي والمغازل والفراغموبلاستات، في المرستيم الجذري للشتلات المعالجة بـ KAND 11. وتماشياً مع الملاحظات الخاصة بـ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS، لوحظ انخفاض كبير في عدد الأنابيب الدقيقة الانقسامية (الشكل 6 ج).
لتقييم سمية KAND 11 على مستوى الخلية، قمنا بمعالجة خلايا التبغ المعلقة BY-2 بـ KAND 11 ورصدنا استجابتها. أضفنا KAND 11 أولًا إلى خلايا BY-2 التي تُعبر عن TagRFP-TUA6، الذي يُوسم الأنيبيبات الدقيقة بالفلورة، لتقييم تأثير KAND 11 على الأنيبيبات الدقيقة القشرية. تم تقييم كثافة الأنيبيبات الدقيقة القشرية باستخدام تحليل الصور، الذي حدد نسبة بكسلات الهيكل الخلوي من بين بكسلات السيتوبلازم. أظهرت نتائج التحليل أنه بعد المعالجة بـ 50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار من KAND 11 لمدة ساعة واحدة، انخفضت الكثافة بشكل ملحوظ إلى 0.94 ± 0.74% أو 0.23 ± 0.28% على التوالي، بينما بلغت كثافة الخلايا المعالجة بـ DMSO 1.61 ± 0.34% (الشكل 7أ). تتوافق هذه النتائج مع الملاحظة في نبات الأرابيدوبسيس بأن المعالجة بـ KAND 11 تحفز تفكك الأنيبيبات الدقيقة القشرية (الشكل 6ب). كما فحصنا سلالة BY-2 ذات خيوط الأكتين الموسومة بـ GFP-ABD بعد المعالجة بنفس تركيز KAND 11، ولاحظنا أن المعالجة بـ KAND 11 أدت إلى تفكك خيوط الأكتين. أدت المعالجة بـ 50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار من KAND 11 لمدة ساعة واحدة إلى انخفاض ملحوظ في كثافة خيوط الأكتين إلى 1.20 ± 0.62% أو 0.61 ± 0.26% على التوالي، بينما كانت الكثافة في الخلايا المعالجة بـ DMSO تساوي 1.69 ± 0.51% (الشكل 2). تتناقض هذه النتائج مع تأثيرات البروبيزاميد، الذي لا يؤثر على خيوط الأكتين، واللاترونكولين ب، وهو مُزيل لبلمرة الأكتين ولا يؤثر على الأنيبيبات الدقيقة (الشكل التكميلي S6). إضافةً إلى ذلك، لم يؤثر العلاج بالكوماموناميد 1، أو حمض الكواموناميد 6، أو KAND 11 على الأنيبيبات الدقيقة في خلايا هيلا (الشكل التكميلي S7). لذا، يُعتقد أن آلية عمل KAND 11 تختلف عن آلية عمل مُعطِّلات الهيكل الخلوي المعروفة. بالإضافة إلى ذلك، كشف فحصنا المجهري لخلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 عن بدء موت الخلايا أثناء المعالجة، وأظهر أن نسبة الخلايا الميتة المصبوغة بصبغة إيفانز الزرقاء لم تزد بشكل ملحوظ بعد 30 دقيقة من المعالجة، بينما بعد 90 دقيقة من المعالجة بتركيز 50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار من KAND، ارتفع عدد الخلايا الميتة إلى 43.7% و80.1% على التوالي (الشكل 7ج). تشير هذه البيانات مجتمعةً إلى أن مشتق حمض الأورسوليك الجديد KAND 11 هو مثبط هيكلي خلوي خاص بالنباتات، وله آلية عمل غير معروفة سابقًا.
يؤثر مركب KAND على الأنيبيبات الدقيقة القشرية، وخيوط الأكتين، وحيوية خلايا التبغ BY-2. (أ) تصوير الأنيبيبات الدقيقة القشرية في خلايا BY-2 بوجود TagRFP-TUA6. تم فحص خلايا BY-2 المعالجة بمركب KAND 11 (بتركيز 50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار) أو DMSO باستخدام المجهر متحد البؤر. حُسبت كثافة الأنيبيبات الدقيقة القشرية من صور مجهرية لـ 25 خلية مستقلة. تشير الأحرف إلى وجود فروق دالة إحصائيًا (اختبار Tukey HSD، p < 0.05).(< 0.05). مقياس الرسم = 10 ميكرومتر. (ب) خيوط الأكتين القشرية في خلايا BY-2 مُصوَّرة في وجود GFP-ABD2. تم فحص خلايا BY-2 المُعالجة بـ KAND 11 (50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) أو DMSO باستخدام المجهر متحد البؤر. حُسبت كثافة خيوط الأكتين القشرية من صور مجهرية لـ 25 خلية مستقلة. تشير الأحرف إلى وجود فروق دالة إحصائيًا (اختبار Tukey HSD، p < 0.05). مقياس الرسم = 10 ميكرومتر.(< 0.05). مقياس الرسم = 10 ميكرومتر. (ج) ملاحظة خلايا BY-2 الميتة باستخدام صبغة إيفانز الزرقاء. تم فحص خلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 (50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) أو DMSO باستخدام المجهر الضوئي. ن = 3. مقياس الرسم = 100 ميكرومتر.
أدى اكتشاف وتطبيق منتجات طبيعية جديدة إلى تقدم كبير في مختلف جوانب حياة الإنسان، بما في ذلك الطب والزراعة. وقد أُجريت أبحاث تاريخية لاستخلاص مركبات مفيدة من الموارد الطبيعية. ومن المعروف أن الأكتينوميسيتات مفيدة كمضادات حيوية مضادة للطفيليات، وخاصة الديدان الأسطوانية، لقدرتها على إنتاج مستقلبات ثانوية متنوعة، مثل الأفرمكتين، وهو المركب الرئيسي للإيفرمكتين والبليوميسين ومشتقاته، المستخدمة طبيًا كعامل مضاد للسرطان.^21،22 وبالمثل، تم اكتشاف مجموعة متنوعة من المركبات المبيدة للأعشاب من الأكتينوميسيتات، بعضها يُستخدم تجاريًا بالفعل.^1،23 لذا، يُعد تحليل مستقلبات الأكتينوميسيتات لعزل المنتجات الطبيعية ذات الأنشطة البيولوجية المطلوبة استراتيجية فعالة. في هذه الدراسة، اكتشفنا مركبًا جديدًا، هو الكوموناميد، من بكتيريا S. werraensis، ونجحنا في تصنيعه. حمض الأورسونيك هو وسيط اصطناعي للأوربيناميد ومشتقاته. قد يُسبب حمض الأورموتونيك تجعدًا مميزًا للجذور، ويُظهر نشاطًا مبيدًا للأعشاب يتراوح بين المتوسط ​​والقوي، ويُلحق الضرر بشكل مباشر أو غير مباشر بالأنيبيبات الدقيقة في النبات. مع ذلك، قد تختلف آلية عمل حمض الأورموتونيك عن آلية عمل مثبطات الأنيبيبات الدقيقة الموجودة، إذ أن مركب KAND 11 يُعطل أيضًا خيوط الأكتين ويُسبب موت الخلايا، مما يُشير إلى آلية تنظيمية يُؤثر من خلالها حمض الأورموتونيك ومشتقاته على نطاق واسع من هياكل الخلية.
سيساعد إجراء المزيد من الدراسات التفصيلية حول حمض الأوربونيك على فهم آلية عمله بشكل أفضل. وعلى وجه الخصوص، يتمثل الهدف التالي في تقييم قدرة حمض الأورسونيك على الارتباط بالأنيبيبات الدقيقة المختزلة لتحديد ما إذا كان حمض الأورسونيك ومشتقاته تعمل بشكل مباشر على الأنيبيبات الدقيقة وتُفككها، أو ما إذا كان تأثيرها يؤدي إلى زعزعة استقرارها. بالإضافة إلى ذلك، في حال عدم استهداف الأنيبيبات الدقيقة بشكل مباشر، فإن تحديد موقع عمل حمض الأورسونيك وأهدافه الجزيئية على الخلايا النباتية سيساعد في فهم خصائص المركبات ذات الصلة بشكل أعمق، والطرق الممكنة لتحسين فعاليته كمبيدات أعشاب. وقد كشف اختبارنا للنشاط الحيوي عن قدرة حمض الأورسونيك الفريدة على إحداث سمية خلوية في نمو نباتات مثل نبات الرشاد (Arabidopsis thaliana) والتبغ وحشيشة الكبد، بينما لم تتأثر خلايا الإشريكية القولونية (E. coli) أو خلايا هيلا (HeLa). وتُعد السمية المنخفضة أو المعدومة للخلايا الحيوانية ميزة لمشتقات حمض الأورسونيك في حال تطويرها كمبيدات أعشاب للاستخدام في الحقول الزراعية المفتوحة. في الواقع، نظرًا لأن الأنيبيبات الدقيقة تُعدّ من البنى الشائعة في حقيقيات النوى، فإن تثبيطها الانتقائي في النباتات يُعدّ شرطًا أساسيًا لمبيدات الأعشاب. على سبيل المثال، يُستخدم البروبيزاميد، وهو عامل مُزيل لبلمرة الأنيبيبات الدقيقة يرتبط مباشرةً بالتوبولين ويُثبّط عملية البلمرة، كمبيد أعشاب نظرًا لانخفاض سميته للخلايا الحيوانية²⁴. وعلى النقيض من الديسوبيراميد، فإن البنزاميدات ذات الصلة لها خصائص استهداف مختلفة. فبالإضافة إلى الأنيبيبات الدقيقة النباتية، يُثبّط كلٌّ من RH-4032 والبنزوكساميد الأنيبيبات الدقيقة في الخلايا الحيوانية أو الفطريات البيضية، على التوالي، ويُستخدم الزاليلاميد كمبيد فطري نظرًا لانخفاض سميته النباتية^25،26،27. يُظهر المركب المكتشف حديثًا ومشتقاته سمية خلوية انتقائية ضد النباتات، ولكن تجدر الإشارة إلى أن إجراء تعديلات إضافية قد يُغيّر من خصائص استهدافها، مما قد يُوفّر مشتقات إضافية لمكافحة الفطريات الممرضة أو الفطريات البيضية.
تُعدّ الخصائص الفريدة لحمض الأوربينونيك ومشتقاته مفيدةً لتطويرها كمبيدات أعشاب واستخدامها كأدوات بحثية. ومن المعروف على نطاق واسع أهمية الهيكل الخلوي في التحكم بشكل الخلية النباتية. وقد أظهرت دراسات سابقة أن النباتات طوّرت آليات معقدة لتنظيم الأنيبيبات الدقيقة القشرية من خلال التحكم في ديناميكيتها للتحكم الأمثل في عملية التشكّل. وقد تم تحديد عدد كبير من الجزيئات المسؤولة عن تنظيم نشاط الأنيبيبات الدقيقة، ولا تزال الأبحاث ذات الصلة جارية.^3،4،28 ولا يُفسّر فهمنا الحالي لديناميكية الأنيبيبات الدقيقة في الخلايا النباتية آليات تنظيمها القشري تفسيراً كاملاً. فعلى سبيل المثال، على الرغم من قدرة كل من الديسوبيراميد والأوريزالين على تفكيك الأنيبيبات الدقيقة، إلا أن الديسوبيراميد يُسبب تشوهاً شديداً في الجذور، بينما يكون تأثير الأوريزالين طفيفاً نسبياً. علاوة على ذلك، تُسبب الطفرات في التوبولين، الذي يُثبّت الأنيبيبات الدقيقة، دورانًا يمينيًا في الجذور، في حين أن الباكليتاكسيل، الذي يُثبّت ديناميكيتها أيضًا، لا يُسبب ذلك. لذا، فإن دراسة وتحديد الأهداف الجزيئية لحمض الأورسوليك من شأنه أن يوفر رؤى جديدة حول تنظيم الأنيبيبات الدقيقة في قشرة النبات. وبالمثل، فإن المقارنات المستقبلية بين المواد الكيميائية الفعالة في تعزيز النمو المشوه، مثل الديسوبيراميد، والمواد الكيميائية الأقل فعالية، مثل الأوريزالين أو حمض الكوماموتوريك، ستوفر أدلة حول كيفية حدوث هذا النمو المشوه.
من جهة أخرى، تُعدّ إعادة ترتيب الهيكل الخلوي المرتبطة بالدفاع احتمالًا آخر لتفسير سمية حمض الأورسونيك. ففي بعض الأحيان، يُؤدي إصابة الخلايا النباتية بمُمرض أو إدخال مُحفز إلى تدمير الهيكل الخلوي وما يتبعه من موت خلوي²⁹. على سبيل المثال، أُفيد أن الكريبتوكسانثين المُستخلص من الفطريات البيضية يُعطّل الأنيبيبات الدقيقة وخيوط الأكتين قبل موت خلايا التبغ، على غرار ما يحدث مع مُعالجة الكاند^30،31. وقد دفعتنا أوجه التشابه بين الاستجابات الدفاعية والاستجابات الخلوية التي يُحفزها حمض الأورسونيك إلى افتراض أنها تُحفز عمليات خلوية مشتركة، على الرغم من وضوح تأثير أسرع وأقوى لحمض الأورسونيك مُقارنةً بالكريبتوكسانثين. ومع ذلك، أظهرت الدراسات أن تعطيل خيوط الأكتين يُعزز الموت الخلوي التلقائي، والذي لا يُصاحبه دائمًا تعطيل الأنيبيبات الدقيقة²⁹. إضافةً إلى ذلك، يبقى أن نرى ما إذا كان المُمرض أو المُحفز يُسبب تشوهًا في نمو الجذور، كما تفعل مُشتقات حمض الأورسونيك. لذا، تُعدّ المعرفة الجزيئية التي تربط بين الاستجابات الدفاعية والهيكل الخلوي مشكلةً جديرةً بالدراسة. ومن خلال استغلال وجود مركبات منخفضة الوزن الجزيئي مرتبطة بحمض الأورسونيك، بالإضافة إلى مجموعة من المشتقات ذات الفعالية المتفاوتة، قد تُتيح هذه المركبات فرصًا لاستهداف آليات خلوية غير معروفة.
سيُسهم اكتشاف وتطبيق مركبات جديدة تُعدّل ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة في توفير أساليب فعّالة لدراسة الآليات الجزيئية المعقدة التي تُحدد شكل الخلية النباتية. وفي هذا السياق، قد يُتيح مركب حمض الأورموتونيك، الذي طُوّر حديثًا ويؤثر على الأنيبيبات الدقيقة وخيوط الأكتين ويُحفز موت الخلايا، فرصةً لفهم العلاقة بين التحكم في الأنيبيبات الدقيقة وهذه الآليات الأخرى. وبالتالي، سيُساعدنا التحليل الكيميائي والبيولوجي باستخدام حمض الأوربونيك على فهم آليات التنظيم الجزيئي التي تُسيطر على الهيكل الخلوي للنبات.
يُلقّح فطر S. werraensis MK493-CF1 في دورق إرلنماير سعة 500 مل مزود بحواجز، يحتوي على 110 مل من وسط الاستنبات المكون من 2% (وزن/حجم) غالاكتوز، و2% (وزن/حجم) معجون خلاصة، و1% (وزن/حجم) تركيبة بكتيريا الصويا (Thermo Fisher Scientific, Inc.)، و0.5% (وزن/حجم) مستخلص ذرة (KOGOSTCH Co., Ltd.، اليابان)، و0.2% (وزن/حجم) كبريتات الأمونيوم، و0.2% كربونات الكالسيوم في ماء منزوع الأيونات. (الأس الهيدروجيني 7.4 قبل التعقيم). تُحضن مزارع البذور على جهاز هزاز دوار (180 دورة في الدقيقة) عند درجة حرارة 27 درجة مئوية لمدة يومين. يُزرع المنتج النهائي عن طريق التخمر في الحالة الصلبة. نُقلت 7 مل من مزرعة البذور إلى قارورة K-1 سعة 500 مل تحتوي على 40 غ من وسط الإنتاج، المُكوّن من 15 غ من الشعير المضغوط (شركة MUSO المحدودة، اليابان) و25 غ من الماء منزوع الأيونات (لم يتم ضبط درجة الحموضة قبل التعقيم). أُجري التخمير عند درجة حرارة 30 درجة مئوية في الظلام لمدة 14 يومًا. استُخلصت مادة التخمير باستخدام 40 مل من الإيثانول لكل قارورة، ثم خُضعت للطرد المركزي (1500 غ، 4 درجات مئوية، 10 دقائق). استُخلص السائل الطافي للمزرعة (60 مل) باستخدام خليط من 10% ميثانول/إيثيل أسيتات. تم تبخير الطبقة العضوية تحت ضغط منخفض للحصول على متبقٍ (59.5 ملغ)، والذي خضع لتحليل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء (HPLC) باستخدام الإذابة المتدرجة (0-10 دقائق: 90%) على عمود طور عكسي (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، 5 ميكرومتر، القطر الداخلي 10 مم × الطول 250 مم) H2O/CH3CN، 10-35 دقيقة: من 90% H2O/CH3CN إلى 70% H2O/CH3CN (متدرج)، 35-45 دقيقة: 90% H2O/EtOH، 45-155 دقيقة: من 90% H2O/EtOH إلى 100% EtOH (متدرج)، 155-200 دقيقة: 100% EtOH) بمعدل تدفق 1.5 مل/دقيقة، تم عزل الكوموناميد (1، 36.0 ملغ) على هيئة مسحوق أبيض مسحوق غير متبلور.
كوماموتو أميد (1)؛ طيف الرنين النووي المغناطيسي للبروتون (500 ميجاهرتز، CDCl3) δ 6.93 (ثلاثية، J = 2.5 هرتز، 1H)، 6.76 (ثنائية مزدوجة، J = 4.3، 1.8 هرتز، 1H)، 6.05 (ثلاثية، J = 3.8 هرتز، 1H)، 4.08 (أحادية، 3H)؛ طيف الرنين النووي المغناطيسي للكربون-13 (125 ميجاهرتز، CDCl3) δ 161.1، 121.0، 119.9، 112.2، 105.0، 68.3؛ ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ القيمة المحسوبة: 141.0659، القيمة المقاسة: 141.0663، IR νmax 3451، 3414، 3173، 2938، 1603، 1593، 1537 سم–1.
تم الحصول على بذور كولومبيا (Col-0) من مركز موارد أرابيدوبسيس البيولوجية (ABRC) بإذنٍ لاستخدامها في الأبحاث. زُرعت بذور Col-0 وحُفظت في ظروف مختبرنا، واستُخدمت كنباتات أرابيدوبسيس من النوع البري. عُقّمت بذور الأرابيدوبسيس سطحيًا، وزُرعت في وسط موراشيغ وسكوج بنصف تركيزه، يحتوي على 2% سكروز (Fujifilm Wako Pure Chemical)، و0.05% (وزن/حجم) من حمض 2-(4-مورفولينو)إيثان سلفونيك (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical)، و1.5% أجار (Fujifilm Wako Pure Chemical)، عند درجة حموضة 5.7، ودرجة حرارة 23 درجة مئوية، وإضاءة مستمرة. تم توفير بذور الطفرة phs1-1 من قِبل ت. هاشيموتو (معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا).
تم الحصول على بذور السلالة SR-1 من ت. هاشيموتو (معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا) واستُخدمت كنباتات تبغ برية. عُقّمت بذور التبغ سطحيًا ونُقعت في ماء معقم لثلاث ليالٍ لتحفيز الإنبات، ثم وُضعت في محلول نصف التركيز يحتوي على 2% سكروز، و0.05% (وزن/حجم) من مادة MES، و0.8% صمغ جيلان (شركة فوجي فيلم واكو بيور كيميكال) (وسط موراشيغ وسكوج) بدرجة حموضة 5.7، وحُضنت عند درجة حرارة 23 درجة مئوية تحت إضاءة مستمرة.
تم الحصول على السلالة Tak-1 من قِبل ت. كوتشي (جامعة كيوتو)، واستُخدمت كوحدة تجريبية قياسية لدراسة حشيشة الكبد. تم استخلاص البراعم من نباتات مُستزرعة مُعقمة، ثم زُرعت على وسط غامبورغ B5 (شركة فوجي فيلم واكو بيور كيميكال) يحتوي على 1% سكروز و0.3% صمغ جيلان، وحُضنت عند درجة حرارة 23 درجة مئوية تحت إضاءة مستمرة.
تم الحصول على خلايا التبغ BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) من S. Hasezawa (جامعة طوكيو). خُففت خلايا BY-2 بمقدار 95 ضعفًا في وسط Linsmeier and Skoog المعدل، وأُضيف إليها حمض 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 أسبوعيًا. خُلط معلق الخلايا على جهاز هزاز دوار بسرعة 130 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 27 درجة مئوية في الظلام. غُسلت الخلايا بعشرة أضعاف حجم الوسط الطازج، ثم أُعيد تعليقها في نفس الوسط. أُنتجت سلالات خلايا BY-2 المعدلة وراثيًا التي تُعبر بشكل مستقر عن واسم الأنابيب الدقيقة TagRFP-TUA6 أو واسم خيوط الأكتين GFP-ABD2 تحت مُحفز فيروس موزاييك القرنبيط 35S، كما هو موضح في المراجع 33 و34 و35. يمكن الحفاظ على هذه السلالات الخلوية ومزامنتها باستخدام إجراءات مماثلة لتلك المستخدمة مع سلالة خلايا BY-2 الأصلية.
تمت زراعة خلايا HeLa في وسط Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) مضافًا إليه 10% من مصل الأبقار الجنيني، و1.2 وحدة/مل من البنسلين، و1.2 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون.
تم إجراء جميع التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة وفقًا للوائح والإرشادات اليابانية الخاصة بالسلامة البيولوجية.
تم إذابة المركبات في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ من شركة Fujifilm Wako Pure Chemical) كمحاليل مركزة، ثم تم تخفيفها في وسط MS لنباتي الرشاد والتبغ، أو في وسط Gamborg B5 لنبات الكبد. ولإجراء اختبار تثبيط نمو الجذور، زُرعت أكثر من 10 بذور في كل طبق على وسط أجار يحتوي على المركبات المذكورة أو DMSO. حُضنت البذور في غرفة نمو لمدة 7 أيام. ثم صُوّرت الشتلات وقيس طول جذورها. أما بالنسبة لاختبار إنبات الرشاد، فزُرعت 48 بذرة في كل طبق على وسط أجار يحتوي على 200 ميكرومول من المركب أو DMSO. نُمت بذور الرشاد في غرفة نمو، وتم عدّ الشتلات النابتة بعد 7 أيام من الإنبات. ولإجراء اختبار إنبات التبغ، زُرعت 24 بذرة في كل طبق على وسط أجار يحتوي على 200 ميكرومول من KAND أو DMSO. زُرعت بذور التبغ في غرفة نمو، وتمّ إحصاء عدد الشتلات النابتة بعد 14 يومًا. ولإجراء اختبار تثبيط نمو حشيشة الكبد، زُرعت 9 أجنة من كل طبق على وسط أجار يحتوي على التراكيز المحددة من KAND أو DMSO، وحُضنت في غرفة نمو لمدة 14 يومًا.
استُخدمت الشتلات المصبوغة بـ 5 ملغم/مل من بروبيديوم يوديد (PI) لتصوير تنظيم المرستيم الجذري. وتمت ملاحظة إشارات PI بواسطة المجهر الفلوري باستخدام مجهر المسح الليزري متحد البؤر TCS SPE (شركة لايكا مايكروسيستمز).
أُجري التلوين النسيجي الكيميائي للجذور باستخدام إنزيم بيتا-غلوكورونيداز (GUS) وفقًا للبروتوكول الموصوف من قِبل مالامي وبنفي³⁶. ثُبِّتت الشتلات في 90% أسيتون طوال الليل، ثم لُوِّنت بمحلول 0.5 ملغم/مل من حمض 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-بيتا-دي-غلوكورونيك في محلول منظم GUS لمدة ساعة واحدة، ووُضِعت في محلول كلورالدهيد مُمَيَّأ (8 غرامات من هيدرات الكلورال، 2 مل من الماء، و1 مل من الجلسرين)، وفُحِصت باستخدام مجهر التباين التفاضلي التداخلي Axio Imager M1 (كارل زايس).
تم قياس زوايا الجذور على شتلات عمرها 7 أيام مزروعة على أطباق موضوعة عموديًا. قِس زاوية الجذر من اتجاه متجه الجاذبية كما هو موضح في الخطوة 6.
تمت ملاحظة ترتيب الأنيبيبات الدقيقة القشرية كما هو موضح، مع تعديلات طفيفة على البروتوكول 37. استُخدم الجسم المضاد لبروتين بيتا-توبولين (KMX-1، ميرك ميليبور: MAB3408) والجسم المضاد IgG المضاد للفأر والمقترن بـ Alexa Fluor 488 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك: A32723) كأجسام مضادة أولية وثانوية بتخفيف 1:1000 و1:100 على التوالي. تم الحصول على صور الفلورة باستخدام مجهر المسح الليزري متحد البؤر TCS SPE (لايكا مايكروسيستمز). يجب الحصول على صور Z-stack وإنشاء إسقاطات الحد الأقصى للكثافة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تم إجراء اختبار تكاثر خلايا هيلا باستخدام مجموعة عد الخلايا 8 (دوجيندو) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تم تحليل نمو E. coli DH5α عن طريق قياس كثافة الخلايا في المزرعة باستخدام مطياف ضوئي عند 600 نانومتر (OD600).
تمت دراسة تنظيم الهيكل الخلوي في خلايا BY-2 المعدلة وراثيًا باستخدام مجهر فلوري مزود بجهاز مسح ضوئي متحد البؤر CSU-X1 (يوكوجاوا) وكاميرا sCMOS (زيلا، أندور تكنولوجي). وقُيِّمَت كثافة الهيكل الخلوي بتحليل الصور، حيث تم تحديد النسبة المئوية لبكسلات الهيكل الخلوي بين بكسلات السيتوبلازم في صور متحد البؤر باستخدام برنامج ImageJ كما هو موضح في المراجع 38 و39.
للكشف عن موت الخلايا في خلايا BY-2، تم تحضين جزء من معلق الخلايا مع محلول أزرق إيفانز بتركيز 0.05% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يعتمد التلوين الانتقائي للخلايا الميتة بأزرق إيفانز على إخراج الصبغة من الخلايا الحية عبر الغشاء البلازمي السليم.⁴⁰ تمت معاينة الخلايا المصبوغة باستخدام مجهر ذي مجال ساطع (BX53، أوليمبوس).
تمت زراعة خلايا هيلا في وسط DMEM مُدعّم بـ 10% من مصل بقري جنيني (FBS) في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون. عُولجت الخلايا بـ 100 ميكرومول من KAND 11، أو حمض الكوماناميميك 6، أو الكوماناميد 1، أو 100 نانوغرام/مل من الكولسيميد (Gibco)، أو 100 نانوغرام/مل من نوكودميز (Sigma) لمدة 6 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ثُبّتت الخلايا بالميثانول لمدة 10 دقائق، ثم بالأسيتات لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. حُضنت الخلايا المُثبّتة مع الجسم المضاد الأولي لبروتين بيتا-توبولين (1D4A4، Proteintech: 66240-1) المُخفف في محلول 0.5% من ألبومين المصل البقري/محلول ملحي فوسفاتي (BSA/PBS) لمدة ساعتين، ثم غُسلت 3 مرات بمحلول TBST، ثم حُضنت مع الجسم المضاد المُستخلص من الماعز والمُوسوم بـ Alexa Fluor لمدة ساعة واحدة. – تم استخدام الغلوبولين المناعي IgG للفأر (Thermo Fisher Scientific: A11001) و15 نانوغرام/مل من صبغة 4'،6-ثنائي أميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) المخففة في محلول 0.5% من ألبومين المصل البقري/محلول الفوسفات الملحي. بعد غسل الخلايا المصبوغة ثلاث مرات بمحلول TBST، تم فحصها باستخدام مجهر نيكون إكليبس Ti-E المقلوب. تم التقاط الصور باستخدام كاميرا Hamamatsu ORCA-R2 CCD المبردة وبرنامج MetaMorph (Molecular Devices).