اكتشاف وتوصيف وتحسين وظيفة أحاديات الأميدات الدبسية كمثبطات جديدة لنمو النبات تؤثر على الأنابيب الدقيقة النباتية.

شكرًا لزيارتك Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحك (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون تنسيق أو جافا سكريبت.
يمكن أن يُسهم اكتشاف المنتجات الطبيعية واستخدامها المُفيد في تحسين حياة الإنسان. تُستخدم المواد الكيميائية المُثبطة لنمو النباتات على نطاق واسع كمبيدات أعشاب لمكافحة الأعشاب الضارة. ونظرًا للحاجة إلى استخدام أنواع مُختلفة من مبيدات الأعشاب، تبرز الحاجة إلى تحديد مُركبات ذات آليات عمل جديدة. في هذه الدراسة، اكتشفنا مُركبًا جديدًا من مجموعة N-ألكوكسي بيرول، وهو الكوماموناميد، من بكتيريا Streptomyces werraensis MK493-CF1، وأنشأنا عملية تصنيع كاملة. ومن خلال اختبارات النشاط البيولوجي، اكتشفنا أن حمض أورس-مونوأميك هو وسيط صناعي لمونو أميد أورس، وهو مُحتمل.مثبط نمو النباتبالإضافة إلى ذلك، طوّرنا مشتقات متنوعة لحمض الأوربينونيك، بما في ذلك مشتق الأوربينيلوكسي (UDA)، الذي يتميز بنشاط مبيدات أعشاب عالي دون التأثير سلبًا على نمو خلايا هيلا. كما وجدنا أن مشتقات حمض الأوربونونيك تُعطّل الأنابيب الدقيقة النباتية؛ بالإضافة إلى ذلك، يؤثر KAND على خيوط الأكتين ويُحفّز موت الخلايا؛ وتختلف هذه التأثيرات متعددة الأوجه عن تأثيرات مثبطات الأنابيب الدقيقة المعروفة، وتشير إلى آلية عمل جديدة لحمض الأوربونونيك، مما يُمثّل ميزة مهمة في تطوير مبيدات أعشاب جديدة.
يُعدّ اكتشاف المنتجات الطبيعية المفيدة ومشتقاتها وتطبيقها العملي وسيلةً لتحسين جودة حياة الإنسان. وقد أدّت المستقلبات الثانوية التي تُنتجها الكائنات الدقيقة والنباتات والحشرات إلى تقدّمٍ كبير في الطب والزراعة. وطُوّرت العديد من المضادات الحيوية وأدوية سرطان الدم من المنتجات الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك، تُستخدم أنواعٌ مختلفة من...المبيدات الحشريةتُستخرج مبيدات الفطريات والأعشاب من هذه المنتجات الطبيعية لاستخدامها في الزراعة. وعلى وجه الخصوص، تُعد مبيدات الأعشاب المستخدمة في مكافحة الأعشاب أدوات مهمة لزيادة إنتاجية المحاصيل في الزراعة الحديثة، وتُستخدم أنواع مختلفة من هذه المركبات تجاريًا. تُعتبر العديد من العمليات الخلوية في النباتات، مثل التمثيل الضوئي، واستقلاب الأحماض الأمينية، وتكوين جدار الخلية، وتنظيم الانقسام الفتيلي، وإشارات الهرمونات النباتية، أو تكوين البروتينات، أهدافًا نموذجية لمبيدات الأعشاب. وتُعتبر المركبات التي تُثبط وظيفة الأنابيب الدقيقة فئة شائعة من مبيدات الأعشاب التي تؤثر على نمو النبات من خلال التأثير على تنظيم الانقسام الفتيلي.
الأنابيب الدقيقة هي مكونات الهيكل الخلوي، وهي محفوظة على نطاق واسع في الخلايا حقيقية النواة. يتكون ثنائي التوبيولين المتغاير من ألفا-توبولين وبيتا-توبولين، مُشكلين خيوطًا أولية خطية من الأنابيب الدقيقة، حيث يُشكل 13 خيطًا أوليًا بنية أسطوانية. تلعب الأنابيب الدقيقة أدوارًا متعددة في الخلايا النباتية، بما في ذلك تحديد شكل الخلية، وانقسامها، والنقل داخل الخلايا3،4. تحتوي الخلايا النباتية على أنابيب دقيقة أسفل الغشاء البلازمي بين الطورين، ويُعتقد أن هذه الأنابيب الدقيقة القشرية تتحكم في تنظيم ألياف السليلوز الدقيقة من خلال تنظيم مُركّبات إنزيم السليلوز سينثاز4،5. تقع الأنابيب الدقيقة القشرية لخلايا البشرة الجذرية، الموجودة في منطقة الاستطالة السريعة لطرف الجذر، جانبيًا، وتتبع ألياف السليلوز الدقيقة هذه الأنابيب الدقيقة وتحد من اتجاه تمدد الخلية، مما يُعزز استطالة الخلايا متباينة الخواص. لذلك، ترتبط وظيفة الأنابيب الدقيقة ارتباطًا وثيقًا بمورفولوجيا النبات. تُسبب استبدالات الأحماض الأمينية في الجينات المُشفِّرة للتيوبيولين انحرافًا في مصفوفات الأنابيب الدقيقة القشرية ونموًا يساريًا أو يمينيًا في نبات أرابيدوبسيس 6،7. وبالمثل، يمكن أن تؤدي الطفرات في البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة، والتي تُنظِّم ديناميكياتها، إلى تشوه نمو الجذور 8،9،10،11،12،13. بالإضافة إلى ذلك، يُسبِّب العلاج بمبيدات الأعشاب المُعطِّلة للأنابيب الدقيقة، مثل ديسوبيراميد، المعروف أيضًا باسم بريتيلاكلور، نموًا مائلًا للجذور يساريًا 14. تُشير هذه البيانات إلى أن التنظيم الدقيق لوظيفة الأنابيب الدقيقة أمرٌ بالغ الأهمية لتحديد اتجاه نمو النبات.
اكتُشفت أنواعٌ مختلفة من مثبطات الأنابيب الدقيقة، وقد أسهمت هذه الأدوية إسهاماتٍ كبيرة في أبحاث الهيكل الخلوي، وكذلك في الزراعة والطب2. وتحديدًا، يُمكن للأوريزالين، ومركبات ثنائي نيتروأنيلين، والديسوبيراميد، والمركبات المرتبطة بالبنزاميد، ونظائرها، أن تُثبط وظيفة الأنابيب الدقيقة، وبالتالي تُعيق نمو النبات. لذلك، تُستخدم على نطاقٍ واسع كمبيدات أعشاب. ومع ذلك، ولأن الأنابيب الدقيقة مُكوّنٌ أساسيٌّ في الخلايا النباتية والحيوانية، فإن مُعظم مثبطات الأنابيب الدقيقة سامةٌ لكلا النوعين من الخلايا. لذلك، على الرغم من فائدتها المُعترف بها كمبيدات أعشاب، إلا أن عددًا محدودًا من العوامل المُضادة للأنابيب الدقيقة يُستخدم لأغراضٍ عملية.
الستربتوميسيس جنس من فصيلة الستربتوميسيس، التي تضم بكتيريا هوائية موجبة الجرام وخيطية، وتشتهر بقدرتها على إنتاج مجموعة واسعة من المستقلبات الثانوية. لذلك، تُعتبر من أهم مصادر المنتجات الطبيعية الجديدة النشطة بيولوجيًا. في هذه الدراسة، اكتشفنا مركبًا جديدًا يُسمى الكوماموناميد، والذي عُزل من ستربتوميسيس ويرينسيس MK493-CF1 وستربتوميسيس ويرينسيس ISP 5486. باستخدام التحليل الطيفي والتحليل الطيفي الكامل، وُصفت بنية الكوماموناميد، وحُدد هيكله الفريد المكون من N-ألكوكسي بيرول. وُجد أن حمض أورسمونيك، وهو وسيط اصطناعي من أورسمونومون أميد ومشتقاته، يُثبط نمو وإنبات نبات أرابيدوبسيس ثاليانا النموذجي الشائع. في دراسةٍ للعلاقة بين البنية والنشاط، وجدنا أن مركبًا يحتوي على C9 مُعدّل إلى حمض أورسونيك، ويُسمى مشتق نونيلوكسي لحمض أورسونيك (KAND)، يُعزز بشكل كبير التأثير المثبط على النمو والإنبات. والجدير بالذكر أن مثبط نمو النبات المُكتشف حديثًا أثر أيضًا على نمو التبغ وحشيشة الكبد، ولم يكن سامًا للبكتيريا أو خلايا هيلا. علاوةً على ذلك، تُسبب بعض مشتقات حمض أورسونيك تشوهًا في النمط الظاهري للجذور، مما يعني أن هذه المشتقات تؤثر بشكل مباشر أو غير مباشر على الأنابيب الدقيقة. وتماشيًا مع هذه الفكرة، تُشير ملاحظاتنا للأنابيب الدقيقة المُوسومة إما مناعيًا نسيجيًا أو ببروتينات فلورية إلى أن معالجة KAND تُفكك الأنابيب الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك، أدت المعالجة بمشتقات حمض الكوماموتونيك إلى تعطيل خيوط الأكتين الدقيقة. وهكذا، اكتشفنا مثبطًا جديدًا لنمو النبات، تتمثل آلية عمله الفريدة في تدمير الهيكل الخلوي.
عُزلت سلالة MK493-CF1 من تربة في شيناغاوا-كو، طوكيو. شكّلت سلالة MK493-CF1 فطريات سترومالية متفرعة جيدًا. حُدّد التسلسل الجزئي لجين الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S (1422 زوجًا قاعديًا). تُشبه هذه السلالة إلى حد كبير سلالة S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486، 1421/1422 زوجًا قاعديًا، T: سلالة نموذجية، 99.93%). بناءً على هذه النتيجة، حُددت صلة هذه السلالة الوثيقة بسلالة S. werraensis النمطية. لذلك، أطلقنا عليها مؤقتًا اسم S. werraensis MK493-CF1. تُنتج سلالة S. werraensis ISP 5486T أيضًا نفس المركبات النشطة بيولوجيًا. ونظرًا لقلة الأبحاث المبكرة في الحصول على المنتجات الطبيعية من هذا الكائن الدقيق، أُجريت المزيد من الأبحاث الكيميائية. بعد زراعة S. werraensis MK493-CF1 في وسط الشعير عن طريق التخمير الصلب عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة 14 يومًا، استُخلص الوسط بتركيز 50% من الإيثانول. جُفِّفت 60 مل من العينة للحصول على 59.5 ملغ من المستخلص الخام. خضع المستخلص الخام لتقنية HPLC في الطور العكسي لإنتاج N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، المسمى كوماموناميد، بتركيز 36.0 ملغ). تبلغ الكمية الإجمالية للـ 1 حوالي 60% من المستخلص الخام. لذلك، قررنا دراسة خصائص كوماموتواميد 1 بالتفصيل.
الكوماموناميد 1 مسحوق أبيض غير متبلور، وقد أثبت مطياف الكتلة عالي الدقة (HRESIMS) وجوده في المركب C6H8N2O2 (الشكل 1). يتميز جزء البيرول المُستبدل بـ C2 لهذا المركب بـ δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 هرتز، H-4)، وδH 6.78 (1H, d, J = 2.5، δH في طيف الرنين النووي المغناطيسي 1H: 4.5 هرتز، H-5)، وδH 6.78 (1H, d, J = 2.5 هرتز، H-6). ويُظهر طيف الرنين النووي المغناطيسي 13C وجود أربع ذرات كربون sp2. تم تقييم وجود مجموعة أميد في موضع C2 من خلال ارتباط HMBC من بروتون C-3 إلى ذرة كربونيل الأميد عند δC 161.1. بالإضافة إلى ذلك، تشير قمم الرنين النووي المغناطيسي للهيدروجين 1H و13C عند δH 4.10 (3H, S) وδC 68.3 إلى وجود مجموعات N-ميثوكسي في الجزيء. على الرغم من عدم تحديد الموقع الصحيح لمجموعة الميثوكسي باستخدام التحليل الطيفي، مثل مطيافية الفرق المُحسَّنة واختصار أوفرهاوزر النووي (NOEDF)، إلا أن N-ميثوكسي-1H-بيرول-2-كاربوكساميد أصبح أول مركب مرشح.
لتحديد التركيب الصحيح للعنصر 1، أُجري تخليق كلي (الشكل 2أ). نتج عن معالجة 2-أمينوبيريدين 2 المتوفر تجاريًا باستخدام m-CPBA أكسيد النيتروجين المقابل 3 في المحصول الكمي. بعد إضافة 2-أمينوأزيدة للعنصر 2، أُجري تفاعل التكثيف الحلقي الذي وصفه أبراموفيتش في البنزين عند درجة حرارة 90 درجة مئوية للحصول على 1-هيدروكسي-1H-بيرول-2-كربونيتريل 5 المطلوب بالجرام. السرعة 60% (مرحلتان). 15، 16. ثم أعطت الميثيل والتحلل المائي للعنصر 4 حمض 1-ميثوكسي-1H-بيرول-2-كربوكسيليك (يُطلق عليه "حمض الكوموتونيك"، 6) بنسبة محصول جيدة (70%، مرحلتان). وأخيرًا، أعطت الأميدة عبر وسيط كلوريد الحمض 6 باستخدام الأمونيا المائية أميد كوماموتو 1 بنسبة محصول 98%. كانت جميع البيانات الطيفية للمادة 1 المصنعة مماثلة للمادة 1 المعزولة، وبالتالي تم تحديد بنية المادة 1؛
تخليق عام وتحليل للنشاط البيولوجي لليوربيناميد وحمض اليوربينيك. (أ) التخليق الكلي لأميد كوماموتو. (ب) زُرعت شتلات أرابيدوبسيس كولومبيا (Col) البرية، عمرها سبعة أيام، على ألواح موراشيج وسكوج (MS) تحتوي على كوماموناميد 6 أو كوماموناميد 1 بالتركيزات الموضحة. مقياس الرسم = 1 سم.
أولاً، قمنا بتقييم الأنشطة البيولوجية لليوربيناميد ومركباته الوسيطة من حيث قدرتها على تعديل نمو النبات. أضفنا تراكيز مختلفة من أورموناميد 1 أو حمض أورمونيك 6 إلى وسط أجار MS، وزرعنا شتلات نبات أرابيدوبسيس ثاليانا فيه. أظهرت هذه الاختبارات أن التركيزات العالية (500 ميكرومولار) من 6 أعاقت نمو الجذور (الشكل 2ب). بعد ذلك، أنتجنا مشتقات مختلفة عن طريق استبدال موضع N1 بـ 6، وأجرينا عليها دراسات العلاقة بين البنية والنشاط (يُشار إلى عملية التخليق التناظري في المعلومات الداعمة). زُرعت شتلات نبات أرابيدوبسيس في وسط يحتوي على 50 ميكرومولار من مشتقات حمض أورمونيك، وقيست طول الجذور، كما هو موضح في الصورة. كما هو موضح في الأشكال 3أ، ب، وS1، تتميز أحماض الكوماو بأطوال مختلفة من سلاسل ألكوكسي خطية (9، 10، 11، 12، و13) أو سلاسل ألكوكسي كبيرة (15، 16، و17) عند الموضع N1. أظهرت المشتقات تثبيطًا ملحوظًا لنمو الجذور. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن استخدام 200 ميكرومولار من 10، 11، أو 17 يثبط الإنبات (الشكلان 3ج وS2).
دراسة العلاقة بين بنية ونشاط أميد كوماموتو والمركبات ذات الصلة. (أ) مخطط بنية وتخليق النظائر. (ب) تحديد طول جذر شتلات عمرها 7 أيام مزروعة على وسط MS مع أو بدون مشتقات كوماموناميد بتركيز 50 ميكرومولار. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة مع المعالجة الوهمية (اختبار t، p< 0.05). ن>١٨. البيانات مُعرَّفة كمتوسط ​​± انحراف معياري. nt تعني "غير مُختَبَرة" لأن أكثر من ٥٠٪ من البذور لم تنبت. (ج) تحديد معدل إنبات البذور المُعالَجة، المُحَضَّنة لمدة ٧ أيام في وسط MS مع أو بدون ٢٠٠ ميكرومولار من الكوماموناميد والمركبات ذات الصلة. تشير العلامات النجمية إلى فروق معنوية مع المعالجة الوهمية (اختبار مربع كاي). العدد = ٩٦.
ومن المثير للاهتمام أن إضافة سلاسل جانبية ألكيل أطول من C9 أدى إلى تقليل النشاط المثبط، مما يشير إلى أن المركبات المرتبطة بحمض الكوماموتويك تتطلب سلاسل جانبية ذات حجم معين لإظهار نشاطها البيولوجي.
لأن تحليل العلاقة بين البنية والنشاط أظهر أن C9 مُعدّل إلى حمض يورسونيك، وأن مشتق النونيلوكسي من حمض يورسونيك (المشار إليه فيما يلي باسم KAND 11) كان مثبط نمو النبات الأكثر فعالية، أجرينا توصيفًا أكثر تفصيلًا لـ KAND 11. أدى علاج نبات أرابيدوبسيس بـ 50 ميكرومولار من KAND 11 إلى منع الإنبات بشكل شبه كامل، بينما ثبطت التركيزات المنخفضة (40، 30، 20، أو 10 ميكرومولار) من KAND 11 نمو الجذور بشكل يعتمد على الجرعة (الشكل 4أ، ب). لاختبار تأثير KAND 11 على قابلية نمو مرستيم الجذر، فحصنا مرستيم الجذر المصبوغ بيوديد البروبيديوم (PI) وقاسنا مساحة المرستيم. كان حجم النسيج الإنشائي للشتلات المزروعة على وسط يحتوي على 25 ميكرومولار من KAND-11 151.1 ± 32.5 ميكرومتر، بينما كان حجم النسيج الإنشائي للشتلات المزروعة على وسط تحكم يحتوي على DMSO 264.7 ± 30.8 ميكرومتر (الشكل 4ج، د)، مما يشير إلى أن KAND-11 يستعيد النشاط الخلوي. الانتشار. النسيج الإنشائي الجذري. وبالتوافق مع ذلك، قلل علاج KAND 11 من كمية إشارة علامة انقسام الخلايا CDKB2؛1p::CDKB2؛1-GUS في النسيج الإنشائي الجذري (الشكل 4هـ) 17. تشير هذه النتائج إلى أن KAND 11 يثبط نمو الجذور عن طريق تقليل نشاط تكاثر الخلايا.
تحليل التأثير المثبط لمشتقات حمض اليوربينونيك (مشتقات اليوربينيلوكسي) على النمو. (أ) شتلات كولين برية بعمر 7 أيام، مزروعة على ألواح MS بتركيزات KAND 11 المشار إليها. مقياس الشريط = 1 سم. (ب) تحديد طول الجذر. تشير الأحرف إلى فروق معنوية (اختبار Tukey HSD، ص 10).< 0.05). ن>١٦. البيانات مُعرَّفة كمتوسط ​​± انحراف معياري. (ج) مجهر بؤري متحد البؤر لجذور كولين من النوع البري، مُصبوغة بيوديد البروبيديوم، مزروعة على ألواح MS مع أو بدون ٢٥ ميكرومولار KAND ١١. تشير الأقواس البيضاء إلى نمو الجذر. شريط المقياس = ١٠٠ ميكرومتر. (د) تحديد حجم نمو الجذر (ن = ١٠ إلى ١١). حُدِّدت الفروق الإحصائية باستخدام اختبار t (p(هـ) مجهر التباين التداخلي التفاضلي (DIC) لمرستيم الجذر الذي يحتوي على بنية CDKB2؛ 1pro: CDKB2؛ 1-GUS ملطخ ومُلطخ على شتلات عمرها 5 أيام مزروعة على ألواح MS مع أو بدون اختبار KAND 25 ميكرومولار.
تم اختبار السمية النباتية لـ KAND 11 باستخدام نبات ثنائي الفلقة آخر، وهو التبغ (Nicotiana tabacum)، وكائن نموذجي رئيسي للنباتات الأرضية، وهو نبات الكبد (Marchantia polymorpha). وكما هو الحال في نبات الأرابيدوبسيس، أنتجت شتلات التبغ SR-1 المزروعة في وسط يحتوي على 25 ميكرومولار من KAND 11 جذورًا أقصر (الشكل 5أ). بالإضافة إلى ذلك، نبتت 40 من أصل 48 بذرة على أطباق تحتوي على 200 ميكرومولار من KAND 11، بينما نبتت جميع البذور الـ 48 على بيئات معالجة وهمية، مما يشير إلى أن التركيزات الأعلى من KAND كانت ذات دلالة إحصائية (ص< 0.05؛ اختبار مربع كاي) يثبط إنبات التبغ. (الشكل 5ب). بالإضافة إلى ذلك، كان تركيز KAND 11 الذي يثبط نمو البكتيريا في نبات الكبد مشابهًا للتركيز الفعال في نبات الأرابيدوبسيس (الشكل 5ج). تشير هذه النتائج إلى أن KAND 11 يمكنه تثبيط نمو مجموعة متنوعة من النباتات. ثم بحثنا في السمية الخلوية المحتملة للمركبات المرتبطة بأحادي أميد الدب في كائنات حية أخرى، وهي خلايا هيلا البشرية وسلالة الإشريكية القولونية DH5α، كممثلين للخلايا الحيوانية والبكتيرية العليا، على التوالي. في سلسلة من اختبارات تكاثر الخلايا، لاحظنا أن الكوماموناميد 1 وحمض الكوماموناميد 6 وKAND 11 لم يؤثروا على نمو خلايا هيلا أو الإشريكية القولونية عند تركيزات 100 ميكرومولار (الشكل 5د، هـ).
تثبيط نمو KAND 11 في الكائنات الحية غير نبات أرابيدوبسيس. (أ) زُرعت شتلات تبغ برية من النوع SR-1، عمرها أسبوعان، على ألواح MS عمودية تحتوي على 25 ميكرومولار من KAND 11. (ب) زُرعت شتلات تبغ برية من النوع SR-1، عمرها أسبوعان، على ألواح MS أفقية تحتوي على 200 ميكرومولار من KAND 11. (ج) براعم عشبة الكبد من النوع Tak-1، عمرها أسبوعان، زُرعت على ألواح Gamborg B5 بالتركيزات المحددة من KAND 11. تشير الأسهم الحمراء إلى الجراثيم التي توقفت عن النمو خلال فترة الحضانة التي استمرت أسبوعين. (د) اختبار تكاثر خلايا HeLa. قُيس عدد الخلايا الحية على فترات زمنية ثابتة باستخدام مجموعة عد الخلايا 8 (Dojindo). كمجموعة ضابطة، عولجت خلايا هيلا بـ 5 ميكروغرام/مل من أكتينوميسين د (Act D)، الذي يثبط نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي ويسبب موت الخلايا. أُجريت التحاليل في ثلاث نسخ. (هـ) اختبار تكاثر خلايا الإشريكية القولونية. حُلل نمو الإشريكية القولونية بقياس OD600. كمجموعة ضابطة، عولجت الخلايا بـ 50 ميكروغرام/مل من الأمبيسلين (Amp)، الذي يثبط تخليق جدار الخلية البكتيرية. أُجريت التحاليل في ثلاث نسخ.
لفهم آلية عمل السمية الخلوية الناتجة عن المركبات المرتبطة باليوراميد، أعدنا تحليل مشتقات حمض الأوربينيك ذات التأثيرات المثبطة المتوسطة، كما هو موضح في الصورة. وكما هو موضح في الشكلين 2ب، 6أ، أنتجت الشتلات المزروعة على أطباق أجار تحتوي على تركيزات عالية (200 ميكرومولار) من حمض الأورموتونيك 6 جذورًا أقصر ومنحنية إلى اليسار (θ = - 23.7 ± 6.1)، بينما أنتجت الشتلات المزروعة على وسط الضبط جذورًا شبه مستقيمة (θ = - 3.8 ± 7.1). من المعروف أن هذا النمو المائل المميز ينتج عن خلل في الأنابيب الدقيقة القشرية14،18. وتماشيًا مع هذه النتيجة، حفزت الأدوية المزعزعة لاستقرار الأنابيب الدقيقة، ديسوبيراميد وأوريزالين، ميلانًا مشابهًا للجذور في ظل ظروف نمونا (الشكلان 2ب، 6أ). في الوقت نفسه، اختبرنا مشتقات حمض الأوروموتونيك واخترنا العديد منها التي، عند تركيزات معينة، حفزت نموًا مائلًا للجذور. غيّرت المركبات 8 و9 و15 اتجاه نمو الجذر عند 75 ميكرومولار و50 ميكرومولار و40 ميكرومولار على التوالي، مما يشير إلى أن هذه المركبات يمكنها زعزعة استقرار الأنابيب الدقيقة بفعالية (الشكل 2ب، 6أ). كما اختبرنا مشتق حمض الأوروموليك الأقوى، KAND 11، عند تركيز أقل (15 ميكرومولار) ووجدنا أن تطبيق KAND 11 يثبط نمو الجذور وأن اتجاه نمو الجذور كان غير متساوٍ، على الرغم من ميله إلى اليسار (الشكل C3). ونظرًا لأن التركيزات العالية من الأدوية المزعزعة لاستقرار الأنابيب الدقيقة تثبط أحيانًا نمو النبات بدلاً من التسبب في إمالة الجذر، فقد قمنا لاحقًا بتقييم احتمالية تأثير KAND 11 على الأنابيب الدقيقة من خلال مراقبة الأنابيب الدقيقة القشرية في خلايا البشرة الجذرية. أظهرت الكيمياء المناعية باستخدام أجسام مضادة لـ β-tubulin في الخلايا البشروية لجذور الشتلات المعالجة بـ 25 ميكرومولار من KAND 11 اختفاء معظم الأنابيب الدقيقة القشرية في الخلايا البشروية في منطقة الاستطالة (الشكل 6ب). تشير هذه النتائج إلى أن حمض الكوماموتونيك ومشتقاته يؤثران بشكل مباشر أو غير مباشر على الأنابيب الدقيقة لتعطيلها، وأن هذه المركبات تُعدّ مثبطات جديدة للأنابيب الدقيقة.
حمض أورسونيك ومشتقاته يُغيّران الأنابيب الدقيقة القشرية في نبات أرابيدوبسيس ثاليانا. (أ) زاوية ميل الجذر المُقاسة بوجود مشتقات مختلفة من حمض أورسونيك بالتركيزات المُشار إليها. كما حُلِّلت آثار مُركَّبين معروفين بتثبيطهما للأنابيب الدقيقة: ديسوبيراميد وأوريزالين. يُظهر الشكل المُلحق المعيار المُستخدم لقياس زاوية نمو الجذر. تُشير العلامات النجمية إلى فروق كبيرة مع المعالجة الوهمية (اختبار t، p).< 0.05). ن>١٩. شريط المقياس = ١ سم. (ب) الأنابيب الدقيقة القشرية في الخلايا البشروية في منطقة الاستطالة. تم تصوير الأنابيب الدقيقة في جذور نبات أرابيدوبسيس كول من النوع البري المزروعة على أطباق MS مع أو بدون ٢٥ ميكرومولار من KAND 11، وذلك باستخدام صبغة مناعية كيميائية باستخدام أجسام مضادة أولية لبيتا توبيولين وأجسام مضادة ثانوية مقترنة بأليكسا فلور. شريط المقياس = ١٠ ميكرومتر. (ج) البنية الانقسامية للأنابيب الدقيقة في النسيج الجذري. تم تصوير الأنابيب الدقيقة باستخدام صبغة مناعية كيميائية. تم حساب البنى الانقسامية، بما في ذلك مناطق الطور التمهيدي والمغازل والبلاستيدات القصبية، من صور متحدة البؤر. تشير الأسهم إلى بنى الأنابيب الدقيقة الانقسامية. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة مع المعالجة الوهمية (اختبار t، p< 0.05). ن>9. شريط المقياس = 50 ميكرومتر.
على الرغم من قدرة أورسا على تعطيل وظيفة الأنابيب الدقيقة، يُتوقع أن تختلف آلية عمله عن عوامل إزالة البلمرة التقليدية للأنابيب الدقيقة. على سبيل المثال، تُحفز التركيزات العالية من عوامل إزالة البلمرة للأنابيب الدقيقة، مثل ديسوبيراميد وأوريزالين، تمددًا متباين الخواص لخلايا البشرة، بينما لا يُحدث KAND 11 ذلك. بالإضافة إلى ذلك، أدى الاستخدام المشترك لـ KAND 11 وديسوبيراميد إلى استجابة مُشتركة لنمو الجذور المُحفز بالديسوبيراميد، ولوحظ تثبيط للنمو المُحفز بالـ KAND 11 (الشكل S4). كما حللنا استجابة طفرة ديسوبيراميد 1-1 (phs1-1) شديدة الحساسية لـ KAND 11. يُظهر phs1-1 طفرة نقطية غير تقليدية في إنزيم توبيولين كيناز، ويُنتج جذورًا أقصر عند معالجته بالديسوبيراميد9،20. أظهرت الشتلات الطافرة phs1-1 المزروعة على وسط أجار يحتوي على KAND 11 جذورًا أقصر مماثلة لتلك المزروعة على ديسوبيراميد (الشكل S5).
بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا هياكل الأنابيب الدقيقة الانقسامية، مثل مناطق الطور التمهيدي، والمغازل، والبلاستيدات القصبية، في مرستيم الجذر للشتلات المعالجة بـ KAND 11. وتماشيًا مع الملاحظات الخاصة بـ CDKB2؛1p::CDKB2؛1-GUS، لوحظ انخفاض كبير في عدد الأنابيب الدقيقة الانقسامية (الشكل 6 ج).
لتوصيف السمية الخلوية لـ KAND 11 بدقة دون الخلوية، عالجنا خلايا تعليق التبغ BY-2 بـ KAND 11 ولاحظنا استجابتها. أضفنا أولاً KAND 11 إلى خلايا BY-2 المعبرة عن TagRFP-TUA6، الذي يسمّ الأنابيب الدقيقة فلوريًا، لتقييم تأثير KAND 11 على الأنابيب الدقيقة القشرية. تم تقييم كثافة الأنابيب الدقيقة القشرية باستخدام تحليل الصور، الذي حدد النسبة المئوية لبكسلات الهيكل الخلوي بين البكسلات السيتوبلازمية. أظهرت نتائج الاختبار أنه بعد المعالجة بـ 50 ميكرومول أو 100 ميكرومول من KAND 11 لمدة ساعة واحدة، انخفضت الكثافة بشكل ملحوظ إلى 0.94 ± 0.74٪ أو 0.23 ± 0.28٪ على التوالي، بينما بلغت كثافة الخلايا المعالجة بـ DMSO 1.61 ± 0.34٪ (الشكل 7أ). تتوافق هذه النتائج مع الملاحظة في نبات أرابيدوبسيس، والتي تُشير إلى أن معالجة KAND 11 تُحفز تفكك الأنابيب الدقيقة القشرية (الشكل 6ب). كما فحصنا خط BY-2 مع خيوط الأكتين المُوسومة بـ GFP-ABD بعد معالجتها بنفس تركيز KAND 11، ولاحظنا أن معالجة KAND 11 أدت إلى خلل في خيوط الأكتين. أدت المعالجة بتركيز 50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار من KAND 11 لمدة ساعة واحدة إلى انخفاض ملحوظ في كثافة خيوط الأكتين إلى 1.20 ± 0.62% أو 0.61 ± 0.26% على التوالي، بينما كانت الكثافة في الخلايا المعالجة بـ DMSO 1.69 ± 0.51% (الشكل 2). (الشكل 7ب). تتناقض هذه النتائج مع تأثيرات بروبيزاميد، الذي لا يؤثر على خيوط الأكتين، ولاترونكولين ب، وهو مُفكك للأكتين لا يؤثر على الأنابيب الدقيقة (الشكل S6 في نظام المعلومات الإحصائية). بالإضافة إلى ذلك، لم يؤثر العلاج بكوماموناميد 1، أو حمض كوماموناميد 6، أو KAND 11 على الأنابيب الدقيقة في خلايا هيلا (الشكل S7 في نظام المعلومات الإحصائية). وبالتالي، يُعتقد أن آلية عمل KAND 11 تختلف عن آلية عمل مُعطِّلات الهيكل الخلوي المعروفة. بالإضافة إلى ذلك، كشفت مراقبتنا المجهرية لخلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 عن بدء موت الخلايا أثناء العلاج، وأظهرت أن نسبة الخلايا الميتة المصبوغة بلون إيفانز الأزرق لم ترتفع بشكل ملحوظ بعد 30 دقيقة من العلاج بـ KAND 11، بينما بعد 90 دقيقة من العلاج بتركيز 50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار من KAND، ارتفعت نسبة الخلايا الميتة إلى 43.7% أو 80.1% على التوالي (الشكل 7ج). تشير هذه البيانات مجتمعةً إلى أن مشتق حمض الأورسوليك الجديد KAND 11 هو مثبط هيكل خلوي خاص بالنباتات، وله آلية عمل غير معروفة سابقًا.
يؤثر KAND على الأنابيب الدقيقة القشرية، وخيوط الأكتين، وحيوية خلايا التبغ BY-2. (أ) تصوير الأنابيب الدقيقة القشرية في خلايا BY-2 بوجود TagRFP-TUA6. فُحصت خلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 (50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار) أو DMSO بواسطة المجهر البؤري. حُسبت كثافة الأنابيب الدقيقة القشرية من صور مجهرية لـ 25 خلية مستقلة. تشير الحروف إلى فروق ذات دلالة إحصائية (اختبار Tukey HSD، ص 10).< 0.05). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) خيوط الأكتين القشرية في خلايا BY-2، مُصوَّرة بوجود GFP-ABD2. فُحصت خلايا BY-2 المُعالَجة بـ KAND 11 (50 ميكرومولار أو 100 ميكرومولار) أو DMSO بواسطة المجهر البؤري. حُسِبَت كثافة خيوط الأكتين القشرية من صور مجهرية لـ 25 خلية مستقلة. تُشير الحروف إلى فروق ذات دلالة إحصائية (اختبار Tukey HSD، ص 10).< 0.05). مقياس الشريط = 10 ميكرومتر. (ج) ملاحظة خلايا BY-2 الميتة باستخدام صبغة إيفانز بلو. فُحصت خلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 (50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد باستخدام مجهر المجال الساطع. عدد العينات = 3. مقياس الشريط = 100 ميكرومتر.
أدى اكتشاف وتطبيق منتجات طبيعية جديدة إلى تطورات كبيرة في مختلف جوانب الحياة البشرية، بما في ذلك الطب والزراعة. وقد أُجريت أبحاث تاريخية للحصول على مركبات مفيدة من الموارد الطبيعية. وعلى وجه الخصوص، تُعرف الفطريات الشعاعية بفائدتها كمضادات حيوية مضادة للطفيليات ضد الديدان الخيطية نظرًا لقدرتها على إنتاج مستقلبات ثانوية متنوعة، مثل الأفيرمكتين، وهو المركب الرئيسي للإيفرمكتين والبليوميسين ومشتقاته، والذي يُستخدم طبيًا كعامل مضاد للسرطان21،22. وبالمثل، اكتُشفت مجموعة متنوعة من المركبات المبيدة للأعشاب من الفطريات الشعاعية، بعضها مستخدم تجاريًا بالفعل1،23. لذلك، يُعد تحليل مستقلبات الفطريات الشعاعية لعزل المنتجات الطبيعية ذات الأنشطة البيولوجية المطلوبة استراتيجية فعّالة. في هذه الدراسة، اكتشفنا مركبًا جديدًا، وهو الكوماموناميد، من S. werraensis وقمنا بتصنيعه بنجاح. حمض أورسوني هو وسيط صناعي لليوربيناميد ومشتقاته. يمكن أن يُسبب تجعدًا مميزًا للجذور، ويُظهر نشاطًا مُبيدًا للأعشاب يتراوح بين المتوسط ​​والقوي، ويُلحق ضررًا مباشرًا أو غير مباشر بالأنابيب الدقيقة النباتية. ومع ذلك، قد تختلف آلية عمل حمض الأوروموتونيك عن آلية عمل مُثبطات الأنابيب الدقيقة الحالية، حيث يُعطل KAND 11 أيضًا خيوط الأكتين ويُسبب موت الخلايا، مما يُشير إلى وجود آلية تنظيمية يُؤثر من خلالها حمض الأوروموتونيك ومشتقاته على مجموعة واسعة من هياكل الهيكل الخلوي.
سيساعد التوصيف التفصيلي لحمض الأوربينونيك على فهم آلية عمله بشكل أفضل. ويتمثل الهدف التالي، على وجه الخصوص، في تقييم قدرة حمض الأوربينونيك على الارتباط بالأنابيب الدقيقة المختزلة لتحديد ما إذا كان حمض الأوربينونيك ومشتقاته يؤثران مباشرةً على الأنابيب الدقيقة ويفككانها، أو ما إذا كان تأثيرهما يؤدي إلى زعزعة استقرارها. بالإضافة إلى ذلك، في حال لم تكن الأنابيب الدقيقة هدفًا مباشرًا، فإن تحديد موقع التأثير والأهداف الجزيئية لحمض الأوربينونيك على الخلايا النباتية سيساعد على فهم خصائص المركبات ذات الصلة بشكل أعمق، والطرق الممكنة لتحسين نشاطه كمبيد للأعشاب. وقد كشف تحليلنا للنشاط الحيوي عن قدرة حمض الأوربينونيك الفريدة على التسمم الخلوي على نمو نباتات مثل نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا، والتبغ، وحشيشة الكبد، في حين لم تتأثر خلايا الإشريكية القولونية ولا خلايا هيلا. ومن مزايا مشتقات حمض الأوربينونيك قلة سميتها للخلايا الحيوانية، أو انعدامها، إذا طُوّرت كمبيدات أعشاب للاستخدام في الحقول الزراعية المفتوحة. في الواقع، بما أن الأنابيب الدقيقة تراكيب شائعة في حقيقيات النوى، فإن تثبيطها الانتقائي في النباتات شرط أساسي لمبيدات الأعشاب. على سبيل المثال، يُستخدم البروبيزاميد، وهو عامل مُفكك للأنابيب الدقيقة يرتبط مباشرةً بالتوبيولين ويمنع البلمرة، كمبيد أعشاب نظرًا لانخفاض سميته على الخلايا الحيوانية.24 وعلى عكس الديسوبيراميد، تتميز البنزاميدات ذات الصلة بخصائص مستهدفة مختلفة. بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة النباتية، يُثبط RH-4032 أو البنزوكساميد أيضًا الأنابيب الدقيقة في الخلايا الحيوانية أو الفطريات البيضية، على التوالي، ويُستخدم الزاليلاميد كمبيد فطريات نظرًا لانخفاض سميته النباتية.25،26،27. يُظهر الدب المُكتشف حديثًا ومشتقاته سمية خلوية انتقائية ضد النباتات، ولكن تجدر الإشارة إلى أن التعديلات الإضافية قد تُغير من خصوصية هدفه، مما قد يُوفر مشتقات إضافية لمكافحة الفطريات أو الفطريات البيضية المُمرضة.
تُعدّ الخصائص الفريدة لحمض الأوربينونيك ومشتقاته مفيدة لتطويرها كمبيدات أعشاب واستخدامها كأدوات بحثية. وتُعرف أهمية الهيكل الخلوي في التحكم في شكل الخلايا النباتية على نطاق واسع. وقد أظهرت دراسات سابقة أن النباتات قد طورت آليات معقدة لتنظيم الأنابيب الدقيقة القشرية من خلال التحكم في ديناميكياتها للتحكم في التكوّن الشكلي بشكل صحيح. وقد تم تحديد عدد كبير من الجزيئات المسؤولة عن تنظيم نشاط الأنابيب الدقيقة، ولا تزال الأبحاث ذات الصلة جارية3،4،28. لا يُفسر فهمنا الحالي لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الخلايا النباتية آليات تنظيم الأنابيب الدقيقة القشرية بشكل كامل. على سبيل المثال، على الرغم من أن كلاً من ديسوبيراميد وأوريزالين يُمكنهما تفكيك الأنابيب الدقيقة، إلا أن ديسوبيراميد يُسبب تشوهًا شديدًا في الجذور، بينما يُحدث أوريزالين تأثيرًا خفيفًا نسبيًا. علاوة على ذلك، فإن الطفرات في التوبيولين، الذي يُثبّت الأنابيب الدقيقة، تُسبب أيضًا دورانًا يمينيًا في الجذور، بينما لا يُسبب باكليتاكسيل، الذي يُثبّت ديناميكيات الأنابيب الدقيقة أيضًا، ذلك. لذلك، من المتوقع أن تُوفر دراسة وتحديد الأهداف الجزيئية لحمض الأورسوليك رؤى جديدة حول تنظيم الأنابيب الدقيقة القشرية النباتية. وبالمثل، ستوفر المقارنات المستقبلية بين المواد الكيميائية الفعالة في تعزيز النمو المشوه، مثل ديسوبيراميد، والمواد الكيميائية الأقل فعالية، مثل أوريزالين أو حمض الكوماموتوريك، أدلةً على كيفية حدوث النمو المشوه.
من ناحية أخرى، تُعدّ إعادة ترتيب الهيكل الخلوي المرتبطة بالدفاع احتمالاً آخر لتفسير السمية الخلوية لحمض الأوروسين. قد تُسبب إصابة مُمْرِض أو إدخال مُحفِّز في الخلايا النباتية أحيانًا تدمير الهيكل الخلوي وموت الخلايا لاحقًا29. على سبيل المثال، أُفيد بأن الكريبتوكسانثين المُشتق من الفطريات البيضية يُعطّل الأنابيب الدقيقة وخيوط الأكتين قبل موت خلايا التبغ، على غرار ما يحدث مع علاج KAND30،31. دفعتنا أوجه التشابه بين الاستجابات الدفاعية والاستجابات الخلوية المُحفَّزة بحمض الأوروسين إلى افتراض أنها تُحفِّز عمليات خلوية شائعة، على الرغم من وضوح تأثير أسرع وأقوى لحمض الأوروسين مُقارنةً بالكريبتوكسانثين. ومع ذلك، أظهرت الدراسات أن تعطيل خيوط الأكتين يُعزز الموت الخلوي التلقائي، والذي لا يُصاحبه دائمًا تعطيل الأنابيب الدقيقة29. بالإضافة إلى ذلك، يبقى أن نرى ما إذا كان المُمْرِض أو المُحفِّز يُسبب نموًا مُشوّهًا للجذور، كما تفعل مُشتقات حمض الأوروسين. لذا، تُعدّ المعرفة الجزيئية التي تربط بين الاستجابات الدفاعية والهيكل الخلوي مشكلةً واعدةً تستحق المعالجة. فمن خلال استغلال وجود مركبات منخفضة الوزن الجزيئي مرتبطة بحمض الأوروسيك، بالإضافة إلى مجموعة من مشتقاته ذات الفعالية المتفاوتة، قد تُتيح فرصًا لاستهداف آليات خلوية مجهولة.
إن اكتشاف وتطبيق مركبات جديدة تُعدّل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة سيوفر أساليب فعّالة لمعالجة الآليات الجزيئية المعقدة الكامنة وراء تحديد شكل الخلية النباتية. في هذا السياق، قد يُتيح مركب حمض أوروموتونيك، الذي طُوّر حديثًا، والذي يؤثر على الأنابيب الدقيقة وخيوط الأكتين ويُحفّز موت الخلايا، فرصةً لفهم العلاقة بين التحكم في الأنابيب الدقيقة وهذه الآليات الأخرى. وبالتالي، سيساعدنا التحليل الكيميائي والبيولوجي باستخدام حمض أوروموتونيك على فهم الآليات التنظيمية الجزيئية التي تُنظّم الهيكل الخلوي للنبات.
قُدِّم S. werraensis MK493-CF1 إلى دورق مخروطي مُزوَّد بحاجز سعة 500 مل، يحتوي على 110 مل من وسط بذري مُكوَّن من 2% (وزن/حجم) جلاكتوز، و2% (وزن/حجم) معجون خلاصة، و1% (وزن/حجم) مُركَّب بكتيريا. الصويا (شركة Thermo Fisher Scientific, Inc.)، و0.5% (وزن/حجم) مستخلص ذرة (شركة KOGOSTCH المحدودة، اليابان)، و0.2% (وزن/حجم) (NH4)2SO4، و0.2% CaCO3 في ماء منزوع الأيونات. (درجة الحموضة 7.4 قبل التعقيم). حُضِّنت مزارع البذور على هزاز دوار (180 دورة/دقيقة) عند درجة حرارة 27 درجة مئوية لمدة يومين. الزراعة الإنتاجية تتم عن طريق التخمير في الحالة الصلبة. نُقلت مزرعة البذور (7 مل) إلى قارورة K-1 سعة 500 مل تحتوي على 40 غ من وسط الإنتاج المكون من 15 غ من الشعير المضغوط (شركة MUSO المحدودة، اليابان) و25 غ من الماء منزوع الأيونات (لم يُضبط الرقم الهيدروجيني قبل التعقيم). أُجريت عملية التخمير عند درجة حرارة 30 درجة مئوية في الظلام لمدة 14 يومًا. استُخلصت مادة التخمير باستخدام 40 مل/زجاجة من الإيثانول، وطُردت بالطرد المركزي (1500 غ، 4 درجات مئوية، 10 دقائق). استُخلص سائل المزرعة العلوي (60 مل) بمزيج من 10% من الميثانول/الإيثانول. تم تبخير الطبقة العضوية تحت ضغط منخفض للحصول على بقايا (59.5 ملجم)، والتي تعرضت لـ HPLC مع إيلوشن متدرج (0-10 دقائق: 90٪) على عمود الطور العكسي (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، 5 ميكرومتر، القطر الداخلي 10 مم × الطول 250 مم) H2O/CH3CN، 10-35 دقيقة: 90٪ H2O/CH3CN إلى 70٪ H2O/CH3CN (تدرج)، 35-45 دقيقة: 90٪ H2O/EtOH، 45-155 دقيقة: 90٪ H2O/EtOH إلى 100٪ EtOH (تدرج (تدرج)، 155-200 دقيقة: 100٪ EtOH) بمعدل تدفق 1.5 مل/دقيقة، تم عزل الكوماموناميد (1، 36.0 ملجم) على شكل أبيض مسحوق غير متبلور.
كوماموتو أميد (1)؛ 1H-NMR (500 ميجا هرتز، CDCl3) δ 6.93 (t، J = 2.5 هرتز، 1H)، 6.76 (dd، J = 4.3، 1.8 هرتز 1H)، 6.05 (t، J = 3.8 هرتز، 1H). )، 4.08 (s، 3H)؛ 13C-NMR (125 ميجا هرتز، CDCl3) δ 161.1، 121.0، 119.9، 112.2، 105.0، 68.3؛ ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ القيمة المحسوبة: 141.0659، القيمة المقاسة: 141.0663، IR νmax 3451، 3414، 3173، 2938، 1603، 1593، 1537 سم–1.
تم الحصول على بذور كولومبيا (Col-0) من مركز الموارد البيولوجية لنبات الأرابيدوبسيس (ABRC) بإذن للاستخدام البحثي. تم إكثار بذور Col-0 وحفظها في ظروف مختبرنا، واستُخدمت كنباتات أرابيدوبسيس برية. عُقِّمت بذور الأرابيدوبسيس سطحيًا وزُرعت في وسط موراشيج وسكوج نصف القوة، يحتوي على 2% سكروز (Fujifilm Wako Pure Chemical)، و0.05% (وزن/حجم) من حمض 2-(4-مورفولينو) إيثان سلفونيك (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical)، و1.5% أجار (Fujifilm Wako Pure Chemical)، بدرجة حموضة 5.7، عند درجة حرارة 23 درجة مئوية وإضاءة ثابتة. تم توفير بذور الطفرة phs1-1 من قِبل ت. هاشيموتو (معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا).
تم توفير بذور سلالة SR-1 من قِبل ت. هاشيموتو (معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا)، واستُخدمت كنباتات تبغ برية. عُقِّمت بذور التبغ سطحيًا ونُقِعَت في ماء مُعقَّم لمدة ثلاث ليالٍ لتعزيز إنباتها، ثم وُضِعَت في محلول نصف مُركَّز يحتوي على 2% سكروز، و0.05% (وزن/حجم) من MES، و0.8% من صمغ الجيلان (Fujifilm Wako Pure Chemical) (وسط موراشيغي وسكوغ) بدرجة حموضة 5.7، وحُضِّنَت عند درجة حرارة 23 درجة مئوية تحت ضوء ثابت.
تم توفير سلالة Tak-1 من قِبل T. Kohchi (جامعة كيوتو)، واستُخدمت كوحدة تجريبية قياسية لدراسة نبات الكبد. تم الحصول على Gemma من نباتات مُزروعة مُعقمة، ثم طُبعت على وسط Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) المُحتوي على 1% سكروز و0.3% صمغ جيلان، وحُضنت عند درجة حرارة 23 درجة مئوية تحت ضوء مستمر.
تم توفير خلايا التبغ BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) بواسطة S. Hasezawa (جامعة طوكيو). تم تخفيف خلايا BY-2 بمقدار 95 ضعفًا في وسط Linsmeier and Skoog المعدل وأضيف إليها أسبوعيًا حمض 2،4-dichlorophenoxyacetic 32. تم خلط معلق الخلايا على هزاز دوار بسرعة 130 دورة في الدقيقة عند 27 درجة مئوية في الظلام. اغسل الخلايا بحجم 10 أضعاف حجم الوسط الطازج وأعد تعليقها في نفس الوسط. تم إنشاء خطوط خلايا BY-2 المعدلة وراثيًا والتي تعبر بشكل ثابت عن علامة الأنابيب الدقيقة TagRFP-TUA6 أو علامة خيوط الأكتين GFP-ABD2 تحت مروج فيروس موزاييك القرنبيط 35S كما هو موضح 33،34،35. يمكن الحفاظ على هذه الخطوط الخلوية ومزامنتها باستخدام إجراءات مماثلة لتلك المستخدمة في خط خلايا BY-2 الأصلي.
تمت تربية خلايا هيلا في وسط إيجل المعدل لدولبيكو (DMEM) (تقنيات الحياة) مع إضافة 10% من مصل الجنين البقري، و1.2 وحدة/مل من البنسلين، و1.2 ميكروجرام/مل من الستربتومايسين في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون.
تم إجراء جميع التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة وفقًا للوائح والمبادئ التوجيهية للسلامة البيولوجية اليابانية.
تم إذابة المركبات في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ Fujifilm Wako Pure Chemical) كمحاليل مخزنة وتم تخفيفها في وسط MS لنبات أرابيدوبسيس والتبغ أو وسط Gamborg B5 لنبات الكبد. بالنسبة لتحليل تثبيط نمو الجذور، تم زرع أكثر من 10 بذور لكل طبق على وسط أجار يحتوي على المركبات المشار إليها أو DMSO. تم تحضين البذور في حجرة نمو لمدة 7 أيام. تم تصوير الشتلات وقياس طول الجذور. بالنسبة لتحليل إنبات نبات أرابيدوبسيس، تم زرع 48 بذرة لكل طبق على وسط أجار يحتوي على مركب 200 ميكرومول أو DMSO. نمت بذور أرابيدوبسيس في حجرة نمو وتم حساب عدد الشتلات المنبتة بعد 7 أيام من الإنبات (dag). بالنسبة لتحليل إنبات التبغ، تم زرع 24 بذرة لكل طبق على وسط أجار يحتوي على 200 ميكرومول من KAND أو DMSO. زُرعت بذور التبغ في حجرة نمو، وحُسب عدد الشتلات المُنبتة بعد ١٤ يومًا. لاختبار تثبيط نمو نبات الكبد، وُضعت تسعة أجنة من كل طبق على وسط أجار يحتوي على التركيزات المحددة من KAND أو DMSO، وحُضنت في حجرة نمو لمدة ١٤ يومًا.
استخدموا شتلات ملطخة بـ 5 ملغ/مل من يوديد البروبيديوم (PI) لتوضيح تنظيم النسيج الجذري. رُصدت إشارات PI بواسطة المجهر الفلوري باستخدام مجهر مسح ليزري متحد البؤر TCS SPE (Leica Microsystems).
أُجريت عملية التلوين الهيستوكيميائي للجذور باستخدام بيتا غلوكورونيداز (GUS) وفقًا للبروتوكول الذي وصفه مالامي وبينفي36. ثُبّتت الشتلات في أسيتون بتركيز 90% طوال الليل، ثم صُبغت بحمض 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-d-غلوكورونيك بتركيز 0.5 ملغ/مل في محلول GUS العازل لمدة ساعة، ووُضعت في محلول كلورالدهيد مُهَيَّأ (8 غ من هيدرات الكلورال، 2 مل من الماء، و1 مل من الجلسرين)، ورُصدت باستخدام مجهر التباين التفاضلي باستخدام مجهر Axio Imager M1 (كارل زايس).
تم قياس زوايا الجذور لشتلات عمرها سبعة أيام مزروعة على ألواح عمودية. قِس زاوية الجذر من اتجاه الجاذبية كما هو موضح في الخطوة 6.
لوحظ ترتيب الأنابيب الدقيقة القشرية كما هو موضح، مع تعديلات طفيفة على البروتوكول 37. استُخدم الجسم المضاد لبيتا توبيولين (KMX-1، ميرك ميليبور: MAB3408) والأجسام المضادة للفأر IgG المقترنة بأليكسا فلور 488 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك: A32723) كأجسام مضادة أولية وثانوية بتخفيفين 1:1000 و1:100، على التوالي. تم التقاط صور فلورية باستخدام مجهر مسح ليزري متحد البؤر TCS SPE (لايكا مايكروسيستمز). التقط صورًا مكدسة Z وأنشئ إسقاطات بأقصى شدة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تم إجراء اختبار تكاثر خلايا هيلا باستخدام مجموعة عد الخلايا 8 (Dojindo) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تم تحليل نمو E. coli DH5α عن طريق قياس كثافة الخلايا في الثقافة باستخدام مطياف ضوئي عند 600 نانومتر (OD600).
رُصد تنظيم الهيكل الخلوي في خلايا BY-2 المُعدّلة وراثيًا باستخدام مجهر فلوري مُزوّد ​​بجهاز مسح بؤري CSU-X1 (يوكوجاوا) وكاميرا sCMOS (زيلا، أندور تكنولوجي). قُيّمت كثافة الهيكل الخلوي بتحليل الصور، الذي حدّد النسبة المئوية لبكسلات الهيكل الخلوي بين البكسلات السيتوبلازمية في الصور البؤرية باستخدام برنامج ImageJ كما هو موضح38،39.
للكشف عن موت الخلايا في خلايا BY-2، حُضِّنت عينة من مُعلَّق الخلايا مع 0.05% من صبغة إيفانز الزرقاء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يعتمد التلوين الانتقائي للخلايا الميتة بصبغة إيفانز الزرقاء على قذف الصبغة من الخلايا الحية بواسطة الغشاء البلازمي السليم40. رُصدت الخلايا المصبوغة باستخدام مجهر ذي مجال ساطع (BX53، أوليمبوس).
زُرعت خلايا هيلا في DMEM مُضافًا إليها 10% من FBS في حاضنة مُرطبة عند درجة حرارة 37 مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. عولجت الخلايا بـ 100 ميكرومولار من KAND 11، وحمض الكوماموناميك 6، وكوماموناميد 1، و100 نانوغرام/مل من كولسيميد (جيبكو)، أو 100 نانوغرام/مل من نوكودميز (سيجما) لمدة 6 ساعات عند درجة حرارة 37 مئوية. ثُبّتت الخلايا باستخدام MetOH لمدة 10 دقائق، ثم باستخدام الأسيتات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. حُضنت الخلايا المُثبّتة باستخدام جسم مضاد أولي لبيتا-توبولين (1D4A4، بروتينتك: 66240-1) مُخفف في 0.5% من BSA/PBS لمدة ساعتين، ثم غُسلت 3 مرات باستخدام TBST، ثم حُضنت باستخدام جسم مضاد للماعز أليكسا فلور. 488 ساعة واحدة. - IgG فأري (Thermo Fisher Scientific: A11001) و15 نانوغرام/مل من 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) مخفف في 0.5% من BSA/PBS. بعد غسله بـ TBST ثلاث مرات، رُصدت الخلايا المصبوغة باستخدام مجهر نيكون إكليبس Ti-E المقلوب. التُقطت الصور بكاميرا Hamamatsu ORCA-R2 CCD مبردة باستخدام برنامج MetaMorph (Molecular Devices).