اكتشاف وتوصيف وتحسين وظيفي لأحاديات ursa كمثبطات جديدة لنمو النبات تؤثر على الأنابيب الدقيقة النباتية.

شكرا لكم لزيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحك (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في هذه الأثناء، ولضمان الدعم المستمر، نعرض الموقع بدون تصميم أو جافا سكريبت.
إن اكتشاف المنتجات الطبيعية واستخدامها بشكل مفيد يمكن أن يساعد في تحسين حياة الإنسان.تستخدم المواد الكيميائية المثبطة لنمو النبات على نطاق واسع كمبيدات أعشاب للسيطرة على الأعشاب الضارة.ونظرا للحاجة إلى استخدام أنواع مختلفة من مبيدات الأعشاب، هناك حاجة لتحديد المركبات ذات آليات العمل الجديدة.في هذه الدراسة، اكتشفنا مركب N -alkoxypyrrole الجديد، الكوماموناميد، من Streptomyces werraensis MK493-CF1 وأنشأنا عملية التوليف الكاملة.من خلال فحوصات النشاط البيولوجي، اكتشفنا أن حمض urs-monoamic هو وسيط اصطناعي لـ urs-monoamide وهو محتملمثبط نمو النبات.بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير العديد من مشتقات حمض الأوربينونيك، بما في ذلك مشتق الأوربينيلوكسي (UDA)، الذي يتمتع بنشاط مبيد للأعشاب عالي دون التأثير سلبًا على نمو خلايا هيلا.لقد وجدنا أيضًا أن مشتقات حمض اليرمونتونيك تعطل الأنابيب الدقيقة النباتية؛بالإضافة إلى ذلك، يؤثر KAND على خيوط الأكتين ويحث على موت الخلايا؛تختلف هذه التأثيرات متعددة الأوجه عن تلك الخاصة بمثبطات الأنابيب الدقيقة المعروفة، وتقترح آلية عمل جديدة لحمض اليرسونيك، وهو ما يمثل ميزة مهمة في تطوير مبيدات أعشاب جديدة.
إن الاكتشاف والتطبيق العملي للمنتجات الطبيعية المفيدة ومشتقاتها هو وسيلة لتحسين نوعية حياة الإنسان.أدت المستقلبات الثانوية التي تنتجها الكائنات الحية الدقيقة والنباتات والحشرات إلى تقدم كبير في الطب والزراعة.تم تطوير العديد من المضادات الحيوية والأدوية المضادة لسرطان الدم من المنتجات الطبيعية.بالإضافة إلى أنواع مختلفة منمبيدات حشريةويتم استخلاص مبيدات الفطريات ومبيدات الأعشاب من هذه المنتجات الطبيعية لاستخدامها في الزراعة.على وجه الخصوص، تعتبر مبيدات الأعشاب لمكافحة الحشائش أدوات مهمة لزيادة إنتاجية المحاصيل في الزراعة الحديثة، ويتم بالفعل استخدام أنواع مختلفة من المركبات تجاريًا.تعتبر العديد من العمليات الخلوية في النباتات، مثل التمثيل الضوئي، أو استقلاب الأحماض الأمينية، أو تخليق جدار الخلية، أو تنظيم الانقسام الفتيلي، أو إشارات الهرمونات النباتية، أو تخليق البروتين، أهدافًا نموذجية لمبيدات الأعشاب.المركبات التي تمنع وظيفة الأنابيب الدقيقة هي فئة شائعة من مبيدات الأعشاب التي تؤثر على نمو النبات من خلال التأثير على التنظيم الانقسامي.
الأنابيب الدقيقة هي مكونات الهيكل الخلوي ويتم حفظها على نطاق واسع في الخلايا حقيقية النواة.يتكون ثنائي التوبولين المغاير من α-tubulin وβ-tubulin لتكوين خيوط أولية خطية دقيقة، مع 13 خيوط أولية تشكل بنية أسطوانية.تلعب الأنابيب الدقيقة أدوارًا متعددة في الخلايا النباتية، بما في ذلك تحديد شكل الخلية، وانقسام الخلايا، والنقل داخل الخلايا.تحتوي الخلايا النباتية على أنابيب دقيقة أسفل الغشاء البلازمي للطور البيني، ويُعتقد أن هذه الأنابيب التي تسمى الأنابيب الدقيقة القشرية تتحكم في تنظيم ألياف السليلوز الدقيقة من خلال تنظيم مجمعات سينسيز السليلوز 4,5.توجد الأنابيب الدقيقة القشرية لخلايا البشرة الجذرية، الموجودة في منطقة الاستطالة السريعة لطرف الجذر، بشكل جانبي، وتتبع ألياف السليلوز الدقيقة هذه الأنابيب الدقيقة وتحد من اتجاه توسع الخلية، وبالتالي تعزز استطالة الخلايا متباينة الخواص.ولذلك، ترتبط وظيفة الأنابيب الدقيقة ارتباطًا وثيقًا بمورفولوجيا النبات.تسبب بدائل الأحماض الأمينية في الجينات التي تشفر التوبولين انحرافًا في صفائف الأنابيب الدقيقة القشرية ونمو الجانب الأيسر أو الأيمن في الأرابيدوبسيس 6،7.وبالمثل، فإن الطفرات في البروتينات المرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة والتي تنظم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة يمكن أن تؤدي أيضًا إلى نمو جذر مشوه8،9،10،11،12،13.بالإضافة إلى ذلك، فإن العلاج بمبيدات الأعشاب التي تسبب تعطيل الأنابيب الدقيقة مثل ديسوبيراميد، المعروف أيضًا باسم بريتيلاكلور، يؤدي أيضًا إلى نمو الجذر المائل على الجانب الأيسر .تشير هذه البيانات إلى أن التنظيم الدقيق لوظيفة الأنابيب الدقيقة أمر بالغ الأهمية لتحديد اتجاه نمو النبات.
تم اكتشاف أنواع مختلفة من مثبطات الأنابيب الدقيقة، وقد قدمت هذه الأدوية مساهمات كبيرة في أبحاث الهيكل الخلوي، وكذلك في الزراعة والطب 2 .على وجه الخصوص، يمكن للأوريزالين ومركبات الدينتروانيلين وديسوبيراميد والمركبات المرتبطة بالبنزاميد ونظائرها أن تمنع وظيفة الأنابيب الدقيقة وبالتالي تمنع نمو النبات.ولذلك، فهي تستخدم على نطاق واسع كمبيدات الأعشاب.ومع ذلك، نظرًا لأن الأنابيب الدقيقة هي عنصر مهم في الخلايا النباتية والحيوانية، فإن معظم مثبطات الأنابيب الدقيقة سامة للخلايا لكلا النوعين من الخلايا.لذلك، على الرغم من فائدتها المعترف بها كمبيدات أعشاب، يتم استخدام عدد محدود من العوامل المضادة للأنيبيبات الدقيقة لأغراض عملية.
الستربتوميسيس (الاسم العلمي: Streptomyces) هو جنس من بكتيريا Streptomyces، والتي تشمل البكتيريا الهوائية، إيجابية الجرام، الخيطية، وهي معروفة على نطاق واسع بقدرتها على إنتاج مجموعة واسعة من المستقلبات الثانوية.ولذلك فهو يعتبر من أهم مصادر المنتجات الطبيعية الجديدة النشطة بيولوجيا.اكتشفنا في الدراسة الحالية مركبًا جديدًا يسمى الكوماموناميد، والذي تم عزله من Streptomyces werraensis MK493-CF1 وS. werraensis ISP 5486. وباستخدام التحليل الطيفي والتحليل الطيفي الكامل، تم تحديد هيكل الكوماموناميد وهيكله الفريد من نوعه N-alkoxypyrrole. تم تحديده.توليف.تم العثور على حمض الأورسمونيك، وهو وسيط اصطناعي من أورسمونواميد ومشتقاته، لمنع نمو وإنبات النبات النموذجي الشهير أرابيدوبسيس ثاليانا.في دراسة العلاقة بين البنية والنشاط، وجدنا أن مركبًا يحتوي على C9 تم تعديله إلى حمض أورسونيك، يسمى مشتق النونيلوكسي من حمض أورسونيك (KAND)، يعزز بشكل كبير التأثير المثبط على النمو والإنبات.ومن الجدير بالذكر أن مثبط نمو النبات المكتشف حديثًا أثر أيضًا على نمو التبغ وعشبة الكبد ولم يكن سامًا للخلايا للبكتيريا أو خلايا هيلا.علاوة على ذلك، فإن بعض مشتقات حمض الأرموتونيك تحفز النمط الظاهري للجذر المشوه، مما يعني أن هذه المشتقات تؤثر بشكل مباشر أو غير مباشر على الأنابيب الدقيقة.تمشيًا مع هذه الفكرة، تشير ملاحظاتنا للأنابيب الدقيقة الموسومة إما كيميائيًا مناعيًا أو ببروتينات الفلورسنت إلى أن علاج KAND يزيل بلمرة الأنابيب الدقيقة.وبالإضافة إلى ذلك، فإن العلاج بمشتقات حمض الكوماموتونيك عطل خيوط الأكتين الدقيقة.وهكذا، اكتشفنا مثبطًا جديدًا لنمو النبات، والذي تتضمن آلية عمله الفريدة تدمير الهيكل الخلوي.
تم عزل سلالة MK493-CF1 من التربة في شيناغاوا-كو، طوكيو.شكلت سلالة MK493-CF1 فطريات اللحمية المتفرعة بشكل جيد.تم تحديد التسلسل الجزئي لجين الريبوسوم RNA 16S (1422 سنة مضت).هذه السلالة تشبه إلى حد كبير S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486، 1421/1422 bp، T: سلالة نموذجية، 99.93٪).بناءً على هذه النتيجة، تم تحديد أن هذه السلالة كانت مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بسلالة نوع S. werraensis.لذلك، قمنا بتسمية هذه السلالة مؤقتًا S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T ينتج أيضًا نفس المركبات النشطة بيولوجيًا.نظرًا لقلة الأبحاث المبكرة حول الحصول على المنتجات الطبيعية من هذه الكائنات الحية الدقيقة، تم إجراء المزيد من الأبحاث الكيميائية.بعد زراعة S. werraensis MK493-CF1 على وسط الشعير عن طريق تخمير الحالة الصلبة عند 30 درجة مئوية لمدة 14 يومًا، تم استخلاص الوسط بنسبة 50٪ EtOH.تم تجفيف 60 مل من العينة للحصول على 59.5 ملجم من المستخلص الخام.تم تعريض المستخلص الخام إلى HPLC طور عكسي لإعطاء N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، يسمى coumamonamide، 36.0 مجم).المبلغ الإجمالي 1 هو حوالي 60٪ من المستخلص الخام.لذلك قررنا أن ندرس بالتفصيل خصائص الكوماموتواميد 1.
الكوماموناميد 1 عبارة عن مسحوق أبيض غير متبلور ويؤكد قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRESIMS) C6H8N2O2 (الشكل 1).يتميز جزء البيرول المستبدل C2 لهذا المركب بـ δH 6.94 (1H، t، J = 2.8، 4.8 هرتز، H-4)، δH 6.78 (1H، d، J = 2.5، δH في طيف الرنين المغناطيسي النووي 1H: 4.5 هرتز ، H-5) و δH 6.78 (1H، d، J = 2.5 هرتز، H-6)، ويظهر طيف الرنين المغناطيسي النووي 13C وجود أربع ذرات كربون sp2.تم تقييم وجود مجموعة أميد في موضع C2 من خلال ارتباط HMBC من بروتون C-3 إلى كربونيل أميد الكربون عند δC 161.1.بالإضافة إلى ذلك، 1 H و13 C NMR تبلغ ذروتها عند δH 4.10 (3H, S) وδC 68.3 تشير إلى وجود مجموعات N-methoxy في الجزيء.على الرغم من أن الموضع الصحيح لمجموعة الميثوكسي لم يتم تحديده بعد باستخدام التحليل الطيفي مثل التحليل الطيفي المعزز واختصار Overhauser النووي (NOEDF)، إلا أن N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide أصبح المركب المرشح الأول.
لتحديد البنية الصحيحة للرقم 1، تم إجراء التوليف الكلي (الشكل 2 أ).أدى علاج 2-أمينوبيريدين 2 المتوفر تجاريًا باستخدام m-CPBA إلى ظهور أكسيد N-3 المقابل في العائد الكمي.بعد 2-أمينوازيدات 2، تم إجراء تفاعل التكثيف الحلقي الذي وصفه أبراموفيتش في البنزين عند 90 درجة مئوية للحصول على 1-هيدروكسي-1H-بيرول-2-كربونيتريل 5 المطلوب بالجرام.السرعة 60% (مرحلتين).15,16.بعد ذلك، أعطى الميثيل والتحلل المائي لـ 4 1-ميثوكسي-1H-بيرول-2-حمض الكربوكسيل (يسمى "حمض الكوتونونيك"، 6) بإنتاجية جيدة (70%، خطوتين).أخيرًا، أعطى التوسط عبر كلوريد الحمض الوسيط 6 باستخدام الأمونيا المائية كوماموتو أميد 1 في محصول 98%.كانت جميع البيانات الطيفية للمركب 1 مماثلة للمعزولة 1، لذلك تم تحديد بنية 1؛
التوليف العام والتحليل للنشاط البيولوجي للأوربيناميد وحمض الأوربينيك.( أ ) التوليف الكامل لأميد كوماموتو.( ب ) تمت زراعة شتلات الأرابيدوبسيس كولومبيا (Col) من النوع البري البالغة من العمر سبعة أيام على صفائح Murashige و Skoog (MS) التي تحتوي على الكوماموناميد 6 أو الكوماموناميد 1 بالتركيزات المشار إليها.شريط النطاق = 1 سم.
أولاً، قمنا بتقييم الأنشطة البيولوجية للأربيناميد والمواد الوسيطة لقدرتها على تعديل نمو النبات.أضفنا تركيزات مختلفة من ursmonamide 1 أو حمض الأورسمونيك 6 إلى وسط MS agar وشتلات Arabidopsis thaliana المزروعة على هذه الوسيلة.أظهرت هذه المقايسات أن التركيزات العالية (500 ميكرومتر) من 6 تمنع نمو الجذر (الشكل 2 ب).بعد ذلك، قمنا بإنشاء مشتقات مختلفة عن طريق استبدال موضع N1 بـ 6 وأجرينا دراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط عليها (يتم وصف عملية التوليف التناظرية في المعلومات الداعمة (SI)).نمت شتلات نبات الأرابيدوبسيس على وسط يحتوي على 50 ميكرومتر من مشتقات حمض أورسونيك، وتم قياس طول الجذر.كما هو موضح في الصورة.كما هو مبين في الأشكال 3a، b، وS1، فإن أحماض الكومامو لها أطوال مختلفة من سلاسل ألكوكسي خطية (9، 10، 11، 12، و13) أو سلاسل ألكوكسي كبيرة (15، 16، و17) عند الموضع N1.أظهرت المشتقات تثبيطاً معنوياً لنمو الجذور.بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن تطبيق 200 ميكرومتر 10 أو 11 أو 17 يمنع الإنبات (الشكلان 3 ج وS2).
دراسة العلاقة بين البنية والنشاط لأميد كوماموتو والمركبات ذات الصلة.( أ ) مخطط هيكل وتوليف نظائرها.( ب ) القياس الكمي لطول جذر الشتلات البالغة من العمر 7 أيام المزروعة على وسط MS مع أو بدون 50 ميكرومتر من مشتقات الكوماموناميد.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة مع العلاج الوهمي (اختبار t، ص<0.05).ن>18. تظهر البيانات على أنها متوسط ​​± SD.nt تعني "لم يتم اختباره" لأن أكثر من 50% من البذور لم تنبت.(ج) القياس الكمي لمعدل إنبات البذور المعالجة المحتضنة لمدة 7 أيام في وسط MS مع أو بدون 200 ميكرومتر من الكوماموناميد والمركبات ذات الصلة.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة مع العلاج الوهمي (اختبار مربع كاي).ن = 96.
ومن المثير للاهتمام أن إضافة سلاسل جانبية ألكيل أطول من C9 خفضت النشاط المثبط، مما يشير إلى أن المركبات المرتبطة بحمض الكوماموتويك تتطلب سلاسل جانبية بحجم معين لإظهار نشاطها البيولوجي.
نظرًا لأن تحليل العلاقة بين البنية والنشاط أظهر أن C9 تم تعديله إلى حمض أورسونيك وأن مشتق النونيلوكسي من حمض أورسونيك (المشار إليه فيما يلي باسم KAND 11) كان أكثر مثبطات نمو النبات فعالية، فقد أجرينا توصيفًا أكثر تفصيلاً لـ KAND 11. مع 50 ميكرومتر KAND 11 منعت الإنبات تمامًا تقريبًا، في حين أن التركيزات المنخفضة (40 أو 30 أو 20 أو 10 ميكرومتر) من KAND 11 تمنع نمو الجذر بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 4 أ، ب).لاختبار ما إذا كان KAND 11 يؤثر على قابلية بقاء النسيج الإنشائي للجذر، قمنا بفحص الأنسجة الإنشائية الجذرية الملطخة بيوديد البروبيديوم (PI) وقياس حجم منطقة النسيج الإنشائي.كان حجم النسيج المارستيم للشتلات المزروعة على وسط يحتوي على 25 ميكرومتر KAND-11 هو 151.1 ± 32.5 ميكرومتر، في حين كان حجم النسيج النسيجي للشتلات المزروعة على وسط تحكم يحتوي على DMSO 264.7 ± 30.8 ميكرومتر (الشكل 4 ج، د) مما يشير إلى أن KAND-11 يستعيد النشاط الخلوي.الانتشار.ميرستيم الجذر.تمشيًا مع هذا، أدى علاج KAND 11 إلى تقليل كمية علامة انقسام الخلايا CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS إشارة في النسيج الإنشائي الجذري (الشكل 4e) 17.تشير هذه النتائج إلى أن KAND 11 يمنع نمو الجذور عن طريق تقليل نشاط تكاثر الخلايا.
تحليل التأثير المثبط لمشتقات حمض الأوربينونيك (مشتقات الأوربينيلوكسي) على النمو.( أ ) شتلات Col من النوع البري عمرها 7 أيام تزرع على ألواح MS مع التركيزات المشار إليها لـ KAND 11. شريط النطاق = 1 سم.( ب ) القياس الكمي لطول الجذر.تشير الحروف إلى اختلافات كبيرة (اختبار Tukey HSD، ص<0.05).ن>16. تظهر البيانات على أنها متوسط ​​± SD.( ج ) الفحص المجهري متحد البؤر لجذور Col من النوع البري الملطخة باليوديد البروبيديوم المزروعة على ألواح MS مع أو بدون 25 ميكرومتر KAND 11. تشير الأقواس البيضاء إلى النسيج الإنشائي الجذري.شريط النطاق = 100 ميكرومتر.(د) القياس الكمي لحجم النسيج الإنشائي الجذري (ن = 10 إلى 11).تم تحديد الاختلافات الإحصائية باستخدام اختبار t (ص<0.05).تمثل الأشرطة متوسط ​​حجم النسيج الإنشائي.( هـ ) الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي (DIC) للنسيج الإنشائي الجذري الذي يحتوي على بنية CDKB2؛1pro: CDKB2؛1-GUS ملطخ وملطخ على شتلات عمرها 5 أيام مزروعة على ألواح MS مع أو بدون مقايسة كاند 25 ميكرومتر.
تم اختبار السمية النباتية لـ KAND 11 بشكل أكبر باستخدام نبات ثنائي الفلقة آخر، وهو التبغ (Nicotiana tabacum)، وكائن حي نموذجي رئيسي للنباتات البرية، وهو نبات الكبد (Marchantia polymorpha).كما هو الحال في الأرابيدوبسيس، أنتجت شتلات التبغ SR-1 المزروعة على وسط يحتوي على 25 ميكرومتر KAND 11 جذورًا أقصر (الشكل 5 أ).بالإضافة إلى ذلك، نبتت 40 من 48 بذرة على أطباق تحتوي على 200 ميكرومتر KAND 11، في حين نبتت جميع البذور الـ 48 على وسائط معالجة وهمية، مما يشير إلى أن التركيزات الأعلى من KAND كانت كبيرة (ص).<0.05؛اختبار تشي -مربع) يمنع إنبات التبغ.(الشكل 5 ب).بالإضافة إلى ذلك، كان تركيز KAND 11 الذي يثبط نمو البكتيريا في نبات الكبد مشابهًا للتركيز الفعال في نبات الأرابيدوبسيس (الشكل 5 ج).تشير هذه النتائج إلى أن KAND 11 يمكن أن يمنع نمو مجموعة متنوعة من النباتات.قمنا بعد ذلك بدراسة السمية الخلوية المحتملة للمركبات المرتبطة بمونواميد الدب في الكائنات الحية الأخرى، وهي خلايا هيلا البشرية وسلالة الإشريكية القولونية DH5α، كممثلين للخلايا الحيوانية والبكتيرية الأعلى، على التوالي.في سلسلة من فحوصات تكاثر الخلايا، لاحظنا أن الكوماموناميد 1 وحمض الكوماموناميديك 6 وKAND 11 لم يؤثروا على نمو خلايا هيلا أو الإشريكية القولونية بتركيزات 100 ميكرومتر (الشكل 5 د، هـ).
تثبيط نمو KAND 11 في الكائنات غير الأرابيدوبسيس.( أ ) تمت زراعة شتلات تبغ SR-1 من النوع البري عمرها أسبوعين على ألواح MS موضوعة رأسياً تحتوي على 25 ميكرومتر KAND 11. ( ب ) تمت زراعة شتلات تبغ SR-1 من النوع البري عمرها أسبوعين على وضع أفقي لوحات MS تحتوي على 200 ميكرومتر KAND 11. ( ج) براعم نبات الكبد Tak-1 من النوع البري البالغة من العمر أسبوعين المزروعة على ألواح Gamborg B5 مع التركيزات المشار إليها لـ KAND 11. تشير الأسهم الحمراء إلى الجراثيم التي توقفت عن النمو خلال فترة الحضانة التي تستغرق أسبوعين فترة.( د ) فحص تكاثر الخلايا لخلايا هيلا.تم قياس عدد الخلايا القابلة للحياة على فترات زمنية محددة باستخدام مجموعة عد الخلايا 8 (Dojindo).كعنصر تحكم، عولجت خلايا هيلا بـ 5 ميكروغرام/مل من الأكتينوميسين D (القانون D)، الذي يمنع نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA) ويسبب موت الخلايا.تم إجراء التحليلات في ثلاث نسخ.( هـ ) فحص تكاثر خلايا الإشريكية القولونية.تم تحليل نمو الإشريكية القولونية عن طريق قياس OD600.كعنصر تحكم، عولجت الخلايا بـ 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسيلين (Amp)، الذي يمنع تخليق جدار الخلية البكتيرية.تم إجراء التحليلات في ثلاث نسخ.
لفك آلية عمل السمية الخلوية الناجمة عن المركبات المرتبطة باليوراميد، قمنا بإعادة تحليل مشتقات حمض اليوربينيك مع تأثيرات مثبطة معتدلة.كما هو موضح في الصورة.كما هو مبين في الأشكال 2 ب، 6 أ، أنتجت الشتلات المزروعة على ألواح أجار تحتوي على تركيزات عالية (200 ميكرومتر) من حمض اليرمونتونيك 6 جذور أقصر ومنحنية إلى اليسار (θ = – 23.7 ± 6.1)، في حين أن الشتلات المزروعة في وسط التحكم، أنتجت الشتلات جذورًا مستقيمة تقريبًا (θ = – 3.8 ± 7.1).ومن المعروف أن هذا النمو المائل المميز ناتج عن خلل في الأنابيب الدقيقة القشرية .تمشيا مع هذه النتيجة ، تسببت الأدوية المزعزعة للاستقرار في الأنابيب الدقيقة ديسوبيراميد وأوريزالين في إمالة جذر مماثلة في ظل ظروف النمو لدينا (الأشكال 2 ب ، 6 أ).وفي الوقت نفسه، قمنا باختبار مشتقات حمض الأرموتونيك واخترنا العديد منها التي، عند تركيزات معينة، تؤدي إلى نمو الجذر المائل.غيرت المركبات 8 و9 و15 اتجاه نمو الجذر عند 75 ميكرومتر، و50 ميكرومتر، و40 ميكرومتر، على التوالي، مما يشير إلى أن هذه المركبات يمكن أن تزعزع استقرار الأنابيب الدقيقة بشكل فعال (الشكل 2 ب، 6 أ).قمنا أيضًا باختبار أقوى مشتق حمض أورسوليك، KAND 11، بتركيز أقل (15 ميكرومتر) ووجدنا أن تطبيق KAND 11 يمنع نمو الجذر وأن اتجاه نمو الجذر كان غير متساوٍ، على الرغم من أنه كان يميل إلى المنحدر إلى اليسار ( الشكل ج3)..نظرًا لأن التركيزات العالية من الأدوية المزعزعة للاستقرار في الأنابيب الدقيقة تمنع أحيانًا نمو النبات بدلاً من التسبب في إمالة الجذر، قمنا لاحقًا بتقييم احتمال تأثير KAND 11 على الأنابيب الدقيقة من خلال مراقبة الأنابيب الدقيقة القشرية في خلايا البشرة الجذرية.أظهرت الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة لـ β-tubulin في خلايا البشرة لجذور الشتلات المعالجة بـ 25 ميكرومتر KAND 11 اختفاء جميع الأنابيب الدقيقة القشرية تقريبًا في خلايا البشرة في منطقة الاستطالة (الشكل 6 ب).تشير هذه النتائج إلى أن حمض الكوماماتونيك ومشتقاته يعمل بشكل مباشر أو غير مباشر على الأنابيب الدقيقة لتعطيلها وأن هذه المركبات هي مثبطات جديدة للأنابيب الدقيقة.
حمض أورسونيك ومشتقاته يغير الأنابيب الدقيقة القشرية في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا.(أ) زاوية ميل الجذر المقاسة في وجود مشتقات مختلفة من حمض الأورموتونيك بالتركيزات المشار إليها.تم أيضًا تحليل تأثيرات مركبين معروفين بتثبيط الأنابيب الدقيقة: ديسوبيراميد وأوريزالين.يُظهر الشكل الداخلي المعيار المستخدم لقياس زاوية نمو الجذر.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة مع العلاج الوهمي (اختبار t، ص<0.05).ن>19. شريط المقياس = 1 سم.(ب) الأنابيب الدقيقة القشرية في خلايا البشرة في منطقة الاستطالة.تم تصور الأنابيب الدقيقة في جذور الأرابيدوبسيس كول من النوع البري المزروعة على ألواح MS مع أو بدون 25 ميكرومتر KAND 11 من خلال تلطيخ كيميائي مناعي باستخدام الأجسام المضادة الأولية β-tubulin والأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ Alexa Fluor.شريط النطاق = 10 ميكرومتر.(ج) التركيب الانقسامي للأنابيب الدقيقة في النسيج الإنشائي الجذري.تم تصور الأنابيب الدقيقة باستخدام تلطيخ المناعي.تم حساب الهياكل الانقسامية، بما في ذلك مناطق الطور الأول، والمغازل، وphragmoplasts، من الصور متحد البؤر.تشير الأسهم إلى هياكل الأنابيب الدقيقة الانقسامية.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة مع العلاج الوهمي (اختبار t، ص<0.05).ن>9. شريط النطاق = 50 ميكرومتر.
على الرغم من أن Ursa لديه القدرة على تعطيل وظيفة الأنابيب الدقيقة، فمن المتوقع أن تكون آلية عملها مختلفة عن عوامل إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة النموذجية.على سبيل المثال، تؤدي التركيزات الأعلى من عوامل إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة مثل ديسوبيراميد وأوريزالين إلى تحفيز توسع متباين الخواص لخلايا البشرة، في حين أن KAND 11 لا يفعل ذلك.بالإضافة إلى ذلك، أدى التطبيق المشترك لـ KAND 11 وديسوبيراميد إلى استجابة مشتركة لنمو الجذر الناجم عن ديسوبيراميد ولوحظ تثبيط النمو الناجم عن KAND 11 (الشكل S4).قمنا أيضًا بتحليل استجابة طفرة ديسوبيراميد 1-1 (phs1-1) شديدة الحساسية لـ KAND 11. يحتوي phs1-1 على طفرة غير أساسية في نقطة توبولين كيناز وينتج جذور أقصر عند معالجته باستخدام ديسوبيراميد 9،20.كان للشتلات الطافرة phs1-1 المزروعة على وسط أجار يحتوي على KAND 11 جذور أقصر مماثلة لتلك المزروعة على ديسوبيراميد (الشكل S5).
بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا هياكل الأنابيب الدقيقة الانقسامية، مثل مناطق الطور الأول، والمغازل، والبلاستيدات الحرة، في النسيج الإنشائي الجذري للشتلات المعالجة بـ KAND 11. بما يتوافق مع الملاحظات الخاصة بـ CDKB2؛1p::CDKB2؛1-GUS، انخفاض كبير في وقد لوحظ عدد الأنابيب الدقيقة الانقسامية (الشكل .6ج).
لتوصيف السمية الخلوية لـ KAND 11 عند الاستبانة تحت الخلوية، قمنا بمعالجة خلايا التبغ المعلقة BY-2 باستخدام KAND 11 ولاحظنا استجابتها.أضفنا أولاً KAND 11 إلى خلايا BY-2 التي تعبر عن TagRFP-TUA6، والتي تقوم بتسمية الأنابيب الدقيقة بشكل فلورسنتي، لتقييم تأثير KAND 11 على الأنابيب الدقيقة القشرية.تم تقييم كثافة الأنابيب الدقيقة القشرية باستخدام تحليل الصور، الذي حدد النسبة المئوية للبكسلات الهيكلية الخلوية بين البكسلات السيتوبلازمية.أظهرت نتائج الفحص أنه بعد العلاج بـ 50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر KAND 11 لمدة ساعة واحدة، انخفضت الكثافة بشكل ملحوظ إلى 0.94 ± 0.74% أو 0.23 ± 0.28%، على التوالي، في حين بلغت كثافة الخلايا المعالجة بـ DMSO 1.61 ± 0.34. ٪ (الشكل 7 أ).تتوافق هذه النتائج مع الملاحظة في نبات الأرابيدوبسيس بأن علاج KAND 11 يحفز إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة القشرية (الشكل 6 ب).قمنا أيضًا بفحص خط BY-2 مع خيوط الأكتين التي تحمل علامة GFP-ABD بعد العلاج بنفس تركيز KAND 11 ولاحظنا أن علاج KAND 11 عطل خيوط الأكتين.أدى العلاج بـ 50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر KAND 11 لمدة ساعة واحدة إلى تقليل كثافة خيوط الأكتين بشكل ملحوظ إلى 1.20 ± 0.62٪ أو 0.61 ± 0.26٪، على التوالي، في حين كانت الكثافة في الخلايا المعالجة بـ DMSO 1.69 ± 0.51٪ (الشكل 2).7 ب).تتناقض هذه النتائج مع تأثيرات البروبيزاميد، الذي لا يؤثر على خيوط الأكتين، ولاترونكولين ب، وهو مزيل بلمرة الأكتين الذي لا يؤثر على الأنابيب الدقيقة (SI الشكل S6).بالإضافة إلى ذلك، لم يؤثر العلاج باستخدام الكوماموناميد 1، أو حمض الكوماموناميد 6، أو كاند 11 على الأنابيب الدقيقة في خلايا هيلا (SI الشكل S7).وبالتالي، يُعتقد أن آلية عمل KAND 11 تختلف عن آلية عمل العوامل المسببة لاختلال الهيكل الخلوي المعروفة.بالإضافة إلى ذلك، كشفت ملاحظتنا المجهرية لخلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 عن بداية موت الخلايا أثناء علاج KAND 11 وأظهرت أن نسبة الخلايا الميتة الملطخة باللون الأزرق لإيفانز لم تزيد بشكل ملحوظ بعد 30 دقيقة من علاج KAND 11، في حين بعد 90 دقيقة من العلاج بـ 50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر KAND، زاد عدد الخلايا الميتة إلى 43.7% أو 80.1%، على التوالي (الشكل 7 ج).تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن مشتق حمض أورسوليك الجديد KAND 11 هو مثبط للهيكل الخلوي خاص بالنبات مع آلية عمل غير معروفة سابقًا.
يؤثر KAND على الأنابيب الدقيقة القشرية، وخيوط الأكتين، وبقاء خلايا التبغ BY-2.( أ ) تصور الأنابيب الدقيقة القشرية في خلايا BY-2 في وجود TagRFP-TUA6.تم فحص خلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 (50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) أو DMSO بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.تم حساب كثافة الأنابيب الدقيقة القشرية من صورة مجهرية لـ 25 خلية مستقلة.تشير الحروف إلى اختلافات كبيرة (اختبار Tukey HSD، ص<0.05).شريط النطاق = 10 ميكرومتر.( ب ) خيوط الأكتين القشرية في خلايا BY-2 مصورة في وجود GFP-ABD2.تم فحص خلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 (50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) أو DMSO بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.تم حساب كثافة خيوط الأكتين القشرية من صورة مجهرية لـ 25 خلية مستقلة.تشير الحروف إلى اختلافات كبيرة (اختبار Tukey HSD، ص<0.05).شريط النطاق = 10 ميكرومتر.( ج ) ملاحظة خلايا BY-2 الميتة بواسطة تلطيخ إيفانز الأزرق.تم فحص خلايا BY-2 المعالجة بـ KAND 11 (50 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) أو DMSO بواسطة الفحص المجهري للمجال الساطع.ن = 3.شريط النطاق = 100 ميكرومتر.
وقد أدى اكتشاف وتطبيق المنتجات الطبيعية الجديدة إلى تقدم كبير في مختلف جوانب حياة الإنسان، بما في ذلك الطب والزراعة.تم إجراء أبحاث تاريخية للحصول على مركبات مفيدة من الموارد الطبيعية.على وجه الخصوص، من المعروف أن الفطريات الشعوية مفيدة كمضادات حيوية مضادة للطفيليات للديدان الخيطية نظرًا لقدرتها على إنتاج مختلف المستقلبات الثانوية مثل الأفيرمكتين، المركب الرئيسي للإيفرمكتين والبليوميسين ومشتقاته، المستخدمة طبيًا كعامل مضاد للسرطان.وبالمثل، تم اكتشاف مجموعة متنوعة من مركبات مبيدات الأعشاب من الشعيات، وبعضها يستخدم تجاريا بالفعل.ولذلك، فإن تحليل مستقلبات الشعيات لعزل المنتجات الطبيعية ذات الأنشطة البيولوجية المرغوبة يعتبر استراتيجية فعالة.اكتشفنا في هذه الدراسة مركبًا جديدًا، الكوماموناميد، من S. werraensis وقمنا بتصنيعه بنجاح.حمض أورسونيك هو وسيط اصطناعي للأوربيناميد ومشتقاته.يمكن أن يسبب تجعدًا مميزًا للجذور، ويظهر نشاطًا مبيدًا للأعشاب متوسطًا إلى قويًا، ويلحق الضرر بشكل مباشر أو غير مباشر بالأنابيب الدقيقة النباتية.ومع ذلك، فإن آلية عمل حمض اليرمونتونيك قد تختلف عن آلية عمل مثبطات الأنابيب الدقيقة الموجودة، حيث أن KAND 11 يعطل أيضًا خيوط الأكتين ويسبب موت الخلايا، مما يشير إلى آلية تنظيمية يؤثر من خلالها حمض اليرمونتونيك ومشتقاته على مجموعة واسعة من الهياكل الهيكلية الخلوية..
سيساعد التوصيف التفصيلي الإضافي لحمض الأوربينونيك على فهم آلية عمل حمض الأوربينونيك بشكل أفضل.على وجه الخصوص، الهدف التالي هو تقييم قدرة حمض اليورسونيك على الارتباط بالأنابيب الدقيقة المختزلة لتحديد ما إذا كان حمض اليورسونيك ومشتقاته يعمل بشكل مباشر على الأنابيب الدقيقة وإزالة بلمرتها، أو ما إذا كان عملها يؤدي إلى زعزعة استقرار الأنابيب الدقيقة.بالإضافة إلى ذلك، في الحالة التي لا تكون فيها الأنابيب الدقيقة هدفًا مباشرًا، فإن تحديد موقع العمل والأهداف الجزيئية لحمض اليرسونيك على الخلايا النباتية سيساعد على فهم خصائص المركبات ذات الصلة والطرق الممكنة لتحسين نشاط مبيدات الأعشاب.كشف اختبار النشاط الحيوي الخاص بنا عن القدرة السامة للخلايا الفريدة لحمض أورسونيك على نمو النباتات مثل أرابيدوبسيس ثاليانا والتبغ ونبتة الكبد، في حين لم تتأثر خلايا الإشريكية القولونية ولا خلايا هيلا.تعتبر سمية ضئيلة أو معدومة للخلايا الحيوانية ميزة لمشتقات حمض اليورسونيك إذا تم تطويرها كمبيدات أعشاب لاستخدامها في الحقول الزراعية المفتوحة.في الواقع، نظرًا لأن الأنابيب الدقيقة هي هياكل شائعة في حقيقيات النوى، فإن تثبيطها الانتقائي في النباتات يعد متطلبًا أساسيًا لمبيدات الأعشاب.على سبيل المثال، يتم استخدام البروبيزاميد، وهو عامل إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة الذي يرتبط مباشرة بالتوبولين ويمنع البلمرة، كمبيد للأعشاب بسبب سميته المنخفضة للخلايا الحيوانية.وعلى النقيض من ديسوبيراميد، فإن البنزاميدات ذات الصلة لها خصائص مستهدفة مختلفة.بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة النباتية، يمنع RH-4032 أو البنزوكساميد أيضًا الأنابيب الدقيقة من الخلايا الحيوانية أو الفطريات البيضية، على التوالي، ويستخدم زاليلاميد كمبيد للفطريات بسبب سميته النباتية المنخفضة.يُظهر الدب المكتشف حديثًا ومشتقاته سمية خلوية انتقائية ضد النباتات، ولكن تجدر الإشارة إلى أن المزيد من التعديلات قد تغير خصوصية الهدف، مما قد يوفر مشتقات إضافية للسيطرة على الفطريات المسببة للأمراض أو الفطريات البيضية.
تعتبر الخصائص الفريدة لحمض الأوربينونيك ومشتقاته مفيدة في تطويرها كمبيدات أعشاب واستخدامها كأدوات بحثية.من المسلم به على نطاق واسع أهمية الهيكل الخلوي في التحكم في شكل الخلية النباتية.أظهرت دراسات سابقة أن النباتات قد طورت آليات معقدة لتنظيم الأنابيب الدقيقة القشرية من خلال التحكم في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة للتحكم بشكل صحيح في التشكل.تم تحديد عدد كبير من الجزيئات المسؤولة عن تنظيم نشاط الأنابيب الدقيقة، وما زالت الأبحاث ذات الصلة مستمرة.إن فهمنا الحالي لديناميات الأنابيب الدقيقة في الخلايا النباتية لا يفسر بشكل كامل آليات تنظيم الأنابيب الدقيقة القشرية.على سبيل المثال، على الرغم من أن كل من ديسوبيراميد وأوريزالين يمكنهما إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة، فإن ديسوبيراميد يسبب تشوهًا شديدًا للجذر بينما يكون للأوريزالين تأثيرًا خفيفًا نسبيًا.علاوة على ذلك، فإن الطفرات في التوبولين، الذي يعمل على استقرار الأنابيب الدقيقة، تسبب أيضًا دورانًا دكستروريًا في الجذور، في حين أن باكليتاكسيل، الذي يعمل أيضًا على استقرار ديناميكيات الأنابيب الدقيقة، لا يفعل ذلك.ولذلك، فإن دراسة وتحديد الأهداف الجزيئية لحمض أورسوليك ينبغي أن توفر رؤى جديدة في تنظيم الأنابيب الدقيقة القشرية النباتية.وعلى نحو مماثل، فإن المقارنات المستقبلية للمواد الكيميائية الفعّالة في تعزيز النمو المشوه، مثل ديسوبيراميد، والمواد الكيميائية الأقل فعالية، مثل أوريزالين أو حمض الكوماموتوريك، سوف توفر أدلة حول كيفية حدوث النمو المشوه.
من ناحية أخرى، تعد إعادة ترتيب الهيكل الخلوي المتعلقة بالدفاع احتمالًا آخر لتفسير السمية الخلوية لحمض اليرسونيك.تؤدي عدوى العامل الممرض أو إدخال المستحث إلى الخلايا النباتية في بعض الأحيان إلى تدمير الهيكل الخلوي وموت الخلايا لاحقًا.على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن الكريبتوكسانثين المشتق من الأوميسيت يعطل الأنابيب الدقيقة وخيوط الأكتين قبل موت خلايا التبغ، على غرار ما يحدث مع علاج KAND.إن أوجه التشابه بين الاستجابات الدفاعية والاستجابات الخلوية الناجمة عن حمض الأورسونيك قادتنا إلى افتراض أنها تؤدي إلى عمليات خلوية مشتركة، على الرغم من أن تأثير حمض الأورسونيك أسرع وأقوى من الكريبتوكسانثين واضح.ومع ذلك، أظهرت الدراسات أن تعطيل خيوط الأكتين يعزز موت الخلايا التلقائي، والذي لا يصاحبه دائمًا اضطراب الأنابيب الدقيقة .بالإضافة إلى ذلك، يبقى أن نرى ما إذا كان العامل الممرض أو المستحث يسبب نموًا مشوهًا للجذور، كما تفعل مشتقات حمض أورسونيك.وبالتالي، فإن المعرفة الجزيئية التي تربط الاستجابات الدفاعية والهيكل الخلوي تمثل مشكلة جذابة يجب معالجتها.ومن خلال استغلال وجود مركبات ذات وزن جزيئي منخفض مرتبطة بحمض اليرسونيك، بالإضافة إلى مجموعة من المشتقات ذات الفعالية المتفاوتة، فإنها قد توفر فرصًا لاستهداف آليات خلوية غير معروفة.
مجتمعة، فإن اكتشاف وتطبيق المركبات الجديدة التي تعدل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة سيوفر طرقًا قوية لمعالجة الآليات الجزيئية المعقدة الكامنة وراء تحديد شكل الخلية النباتية.في هذا السياق، فإن حمض الأرموتونيك المركب الذي تم تطويره مؤخرًا، والذي يؤثر على الأنابيب الدقيقة وخيوط الأكتين ويحفز موت الخلايا، قد يوفر فرصة لفك العلاقة بين التحكم في الأنابيب الدقيقة وهذه الآليات الأخرى.وبالتالي، فإن التحليل الكيميائي والبيولوجي باستخدام حمض الأوربينونيك سيساعدنا على فهم الآليات التنظيمية الجزيئية التي تتحكم في الهيكل الخلوي للنبات.
تطعيم S. werraensis MK493-CF1 في قارورة مخروطية محيرة سعة 500 مل تحتوي على 110 مل من البذور المتوسطة التي تتكون من 2% (وزن/حجم) اللبن، 2% (وزن/حجم) عجينة الجوهر، 1% (وزن/حجم) تكوين البكتيريا .- سويتون (Thermo Fisher Scientific, Inc.)، مستخلص الذرة 0.5% (وزن/حجم) (KOGOSTCH Co., Ltd.، اليابان)، 0.2% (وزن/حجم) (NH4)2SO4 و0.2% CaCO3 في الماء منزوع الأيونات.(الرقم الهيدروجيني 7.4 قبل التعقيم).تم تحضين مزارع البذور على شاكر دوار (180 دورة في الدقيقة) عند 27 درجة مئوية لمدة يومين.زراعة الإنتاج عن طريق تخمير الحالة الصلبة.تم نقل ثقافة البذور (7 مل) إلى قارورة K-1 سعة 500 مل تحتوي على 40 جم من وسط الإنتاج الذي يتكون من 15 جم من الشعير المضغوط (MUSO Co., Ltd.، اليابان) و25 جم من الماء منزوع الأيونات (لم يتم تعديل الرقم الهيدروجيني قبل التعقيم).).تم إجراء التخمير عند 30 درجة مئوية في الظلام لمدة 14 يومًا.تم استخلاص مادة التخمير باستخدام 40 مل/زجاجة EtOH وتم طردها مركزيًا (1500 جم، 4 درجات مئوية، 10 دقائق).تم استخلاص طاف الثقافة (60 مل) بمزيج من 10% MeOH/EtOAc.تم تبخير الطبقة العضوية تحت ضغط مخفض للحصول على بقايا (59.5 مجم)، والتي تم إخضاعها لـ HPLC مع شطف متدرج (0-10 دقائق: 90%) على عمود طور عكسي (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، 5 ميكرومتر، ID 10 مم × الطول 250 مم) H2O/CH3CN، 10-35 دقيقة: 90% H2O/CH3CN إلى 70% H2O/CH3CN (متدرج)، 35-45 دقيقة: 90% H2O/EtOH، 45-155 دقيقة: 90% H2O / EtOH إلى 100٪ EtOH (التدرج (التدرج)، 155-200 دقيقة: 100٪ EtOH) بمعدل تدفق 1.5 مل / دقيقة، تم عزل الكوماموناميد (1، 36.0 مجم) كمسحوق أبيض غير متبلور.
كوماموتاميد (1)؛1H-NMR (500 ميجاهرتز، CDCl3) δ 6.93 (t، J = 2.5 هرتز، 1H)، 6.76 (dd، J = 4.3، 1.8 هرتز 1H)، 6.05 (t، J = 3.8 هرتز، 1H).)، 4.08 (ق، 3H)؛13C-NMR (125 ميجاهرتز، CDCl3) δ 161.1، 121.0، 119.9، 112.2، 105.0، 68.3؛ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ القيمة المحسوبة: 141.0659، القيمة المقاسة: 141.0663، IR νmax 3451، 3414، 3173، 2938، 1603، 1593، 1537 سم–1.
تم الحصول على بذور كولومبيا (Col-0) من مركز الأرابيدوبسيس للموارد البيولوجية (ABRC) بإذن للاستخدام البحثي.تم نشر بذور Col-0 والحفاظ عليها في ظل ظروف مختبرنا واستخدامها كنباتات أرابيدوبسيس من النوع البري.تم تعقيم بذور الأرابيدوبسيس وزراعتها في وسط Murashige وSkoog بنصف القوة الذي يحتوي على 2% سكروز (Fujifilm Wako Pure Chemical)، 0.05% (وزن/حجم) 2-(4-مورفولينو) حمض إيثان سلفونيك (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) وأجار 1.5% (Fujifilm Wako Pure Chemical)، درجة حموضة 5.7، عند 23 درجة مئوية وضوء ثابت.تم توفير بذور المتحولة phs1-1 بواسطة T. Hashimoto (معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا).
تم توفير بذور سلالة SR-1 بواسطة T. Hashimoto (معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا) واستخدمت كنباتات تبغ برية.تم تعقيم سطح بذور التبغ ونقعها في ماء معقم لمدة ثلاث ليال لتعزيز الإنبات، ثم وضعها في محلول نصف قوة يحتوي على 2% سكروز، و0.05% (وزن/حجم) MES، و0.8% صمغ جيلان (Fujifilm Wako Pure Chemical). موراشيجي.ووسط Skoog) مع درجة الحموضة 5.7 وحضنت عند 23 درجة مئوية تحت ضوء ثابت.
تم توفير Strain Tak-1 بواسطة T. Kohchi (جامعة كيوتو) وتم استخدامه كوحدة تجريبية قياسية لدراسة نباتات الكبد.تم الحصول على Gemma من نباتات مزروعة معقمة ثم تم طلاؤها على وسط Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) الذي يحتوي على 1% سكروز و0.3% صمغ جيلان وحضنت عند درجة حرارة 23 مئوية تحت ضوء مستمر.
تم توفير خلايا التبغ BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) بواسطة S. Hasezawa (جامعة طوكيو).وتم تخفيف خلايا BY-2 95 مرة في وسط Linsmeier وSkoog المعدل، واستكملت أسبوعيًا بحمض 2،4-ثنائي كلوروفينوكسي أسيتيك 32.تم خلط تعليق الخلية على شاكر دوار عند 130 دورة في الدقيقة عند 27 درجة مئوية في الظلام.غسل الخلايا مع 10 أضعاف حجم المتوسطة الطازجة وريسوسبيند في نفس المتوسطة.تم إنشاء خطوط الخلايا المعدلة وراثيا BY-2 التي تعبر بشكل ثابت عن علامة الأنابيب الدقيقة TagRFP-TUA6 أو علامة خيوط الأكتين GFP-ABD2 تحت مروج فيروس فسيفساء القرنبيط 35S كما هو موصوف.يمكن صيانة خطوط الخلايا هذه ومزامنتها باستخدام إجراءات مشابهة لتلك المستخدمة لخط الخلايا BY-2 الأصلي.
تم استزراع خلايا هيلا في وسط نسر Dulbecco المعدّل (DMEM) (تقنيات الحياة) المُضاف إلى 10٪ من مصل الأبقار الجنيني، و1.2 وحدة / مل من البنسلين، و1.2 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في حاضنة تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
تم إجراء جميع التجارب الموضحة في هذه المخطوطة وفقًا للوائح والمبادئ التوجيهية اليابانية للسلامة الأحيائية.
تم إذابة المركبات في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ Fujifilm Wako Pure Chemical) كمحاليل مخزون وتم تخفيفها في وسط MS لـ Arabidopsis والتبغ أو وسط Gamborg B5 لنبات الكبد.بالنسبة لفحص تثبيط نمو الجذر، تم زرع أكثر من 10 بذور لكل لوحة على وسط أجار يحتوي على المركبات المشار إليها أو DMSO.تم تحضين البذور في غرفة النمو لمدة 7 أيام.تم تصوير الشتلات وقياس طول الجذور.لفحص إنبات الأرابيدوبسيس، تم زرع 48 بذرة لكل طبق على وسط أجار يحتوي على 200 ميكرومتر مركب أو DMSO.نمت بذور الأرابيدوبسيس في غرفة النمو وتم حساب عدد الشتلات النابتة بعد 7 أيام من الإنبات (داج).لفحص إنبات التبغ، تم زرع 24 بذرة لكل طبق على وسط أجار يحتوي على 200 ميكرومتر KAND أو DMSO.تمت زراعة بذور التبغ في غرفة النمو وتم حساب عدد الشتلات النابتة بعد 14 يومًا.بالنسبة لفحص تثبيط نمو حشيشة الكبد، تم طلاء 9 أجنة من كل لوحة على وسط أجار يحتوي على التركيزات المشار إليها من KAND أو DMSO وحضنت في غرفة النمو لمدة 14 يومًا.
استخدام الشتلات ملطخة 5 ملغ / مل يوديد البروبيديوم (PI) لتصور تنظيم meristem الجذر.تمت ملاحظة إشارات PI بواسطة الفحص المجهري الفلوري باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر TCS SPE (Leica Microsystems).
تم إجراء تلطيخ كيميائي نسيجي للجذور باستخدام β-glucuronidase (GUS) وفقًا للبروتوكول الموصوف بواسطة Malami وBenfey.تم تثبيت الشتلات في 90٪ من الأسيتون طوال الليل، وملطخة بـ 0.5 مجم / مل 5-برومو-4-كلورو-3-إيندوليل-β-د-حمض الجلوكورونيك في محلول GUS لمدة ساعة واحدة ووضعها في محلول كلورالدهيد مائي.(8 جم هيدرات كلورال، 2 مل ماء و1 مل جلسرين) وتم ملاحظتها بواسطة الفحص المجهري للتداخل التفاضلي باستخدام مجهر Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
تم قياس زوايا الجذر على شتلات عمرها 7 أيام نمت على ألواح موضوعة رأسياً.قم بقياس زاوية الجذر من اتجاه ناقل الجاذبية كما هو موضح في الخطوة 6.
وقد لوحظ ترتيب الأنابيب الدقيقة القشرية كما هو موضح، مع تعديلات طفيفة على البروتوكول 37.تم استخدام الجسم المضاد لـ β-tubulin (KMX-1، Merk Millipore: MAB3408) وIgG المضاد للفأر Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) كأجسام مضادة أولية وثانوية عند التخفيفات 1: 1000 و1: 100، على التوالى.تم الحصول على صور مضان باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر TCS SPE (Leica Microsystems).الحصول على الصور Z-المكدس وإنشاء أقصى قدر من التوقعات كثافة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
تم إجراء اختبار تكاثر خلايا HeLa باستخدام Cell Counting Kit 8 (Dojindo) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تم تحليل نمو E. coli DH5α عن طريق قياس كثافة الخلية في الثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 600 نانومتر (OD600).
وقد لوحظ تنظيم الهيكل الخلوي في خلايا BY-2 المعدلة وراثيا باستخدام مجهر مضان مجهز بجهاز مسح متحد البؤر CSU-X1 (Yokogawa) وكاميرا sCMOS (Zyla، Andor Technology).تم تقييم كثافة الهيكل الخلوي عن طريق تحليل الصور، والذي حدد النسبة المئوية للبيكسلات الهيكلية الخلوية بين البكسلات السيتوبلازمية في الصور البؤرية باستخدام برنامج ImageJ كما هو موضح.
للكشف عن موت الخلايا في خلايا BY-2، تم تحضين قسامة من تعليق الخلية بنسبة 0.05% من لون إيفانز الأزرق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.يعتمد تلطيخ إيفانز الأزرق الانتقائي للخلايا الميتة على قذف الصبغة من الخلايا القابلة للحياة بواسطة غشاء البلازما السليم.وقد لوحظت الخلايا الملطخة باستخدام مجهر المجال الساطع (BX53، أوليمبوس).
نمت خلايا هيلا في DMEM مع إضافة 10% FBS في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون.عولجت الخلايا بـ 100 ميكرومتر KAND 11 أو حمض الكوماموناميك 6 أو الكوماموناميد 1 أو 100 نانوغرام / مل كولسيميد (جيبكو) أو 100 نانوغرام / مل نوكودماز (سيجما) لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية.تم إصلاح الخلايا باستخدام MetOH لمدة 10 دقائق ثم باستخدام الأسيتات لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة.تم تحضين الخلايا الثابتة باستخدام الجسم المضاد الأساسي β-tubulin (1D4A4، Proteintech: 66240-1) المخفف في 0.5% BSA/PBS لمدة ساعتين، وغسله 3 مرات باستخدام TBST، ثم تم تحضينه باستخدام الجسم المضاد للماعز Alexa Fluor.488 1 ساعة.- IgG للماوس (Thermo Fisher Scientific: A11001) و15 نانوغرام/مل 4′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) مخفف في 0.5% BSA/PBS.بعد الغسيل باستخدام TBST ثلاث مرات، تمت ملاحظة الخلايا الملطخة على المجهر المقلوب Nikon Eclipse Ti-E.تم التقاط الصور باستخدام كاميرا Hamamatsu ORCA-R2 CCD المبردة باستخدام برنامج MetaMorph (الأجهزة الجزيئية).