مزيج من مركبات التربين القائمة على الزيوت العطرية النباتية كعلاج قاتل لليرقات والبالغين ضد بعوضة الزاعجة المصرية (ذات الجناحين: البعوضيات)

شكرًا لزيارتك Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحك (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون تنسيق أو جافا سكريبت.
قد تُظهر تركيبات المركبات المُبيدة للحشرات المُشتقة من النباتات تفاعلات تآزرية أو مُضادة ضد الآفات. ونظرًا للانتشار السريع للأمراض التي تحملها بعوضة الزاعجة المصرية، وتزايد مقاومة أسرابها للمبيدات الحشرية التقليدية، صُممت ثمانية وعشرون تركيبة من مركبات التربين المُشتقة من الزيوت العطرية النباتية، واختُبرت ضد مراحل اليرقات والبالغات من بعوضة الزاعجة المصرية. قُيِّمت خمسة زيوت عطرية نباتية (EOs) مبدئيًا من حيث فعاليتها في قتل اليرقات والبالغات، وتم تحديد مُركَّبين رئيسيين في كل زيت عطري بناءً على نتائج كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة (GC-MS). تم شراء المركبات الرئيسية المُحددة، وهي ثنائي كبريتيد الأليل، وثنائي كبريتيد الأليل، والكارفون، والليمونين، والأوجينول، وميثيل يوجينول، والأوكاليبتول، واليوديسمول، وألفا بينين البعوض. تم بعد ذلك تحضير تركيبات ثنائية من هذه المركبات باستخدام جرعات دون مميتة، واختُبرت وحُددت تأثيراتها التآزرية والمضادة. وتُحصل على أفضل التركيبات القاتلة لليرقات بخلط الليمونين مع ثنائي كبريتيد الأليل، بينما تُحصل على أفضل التركيبات القاتلة للحشرات البالغة بخلط الكارفون مع الليمونين. واختُبر مبيد اليرقات الاصطناعي المُستخدم تجاريًا، تيمفوس، ودواء الملاثيون للبالغين، بشكل منفصل وفي تركيبات ثنائية مع التربينويدات. وأظهرت النتائج أن تركيبة التيمفوس مع ثنائي كبريتيد الأليل، والمالاثيون مع يوديسمول، كانت التركيبة الأكثر فعالية. وتُحتمل استخدام هذه التركيبات القوية ضد بعوضة الزاعجة المصرية.
الزيوت العطرية النباتية (EOs) هي مُستقلَبات ثانوية تحتوي على مُركّبات حيوية مُختلفة، وتزداد أهميتها كبديل للمبيدات الحشرية المُصنّعة. فهي ليست صديقة للبيئة وسهلة الاستخدام فحسب، بل هي أيضًا مزيج من مُركّبات حيوية مُختلفة، مما يُقلّل من احتمالية تطوير مقاومة للأدوية. باستخدام تقنية كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة (GC-MS)، فحص الباحثون مُكوّنات مُختلف الزيوت العطرية النباتية، وحدّدوا أكثر من 3000 مُركّب من 17500 نبتة عطرية.2، خضع مُعظمها لاختبارات خصائص مُبيدة للحشرات، وأُفيد بأنّ لها تأثيرات مُبيدة للحشرات.3،4. تُشير بعض الدراسات إلى أنّ سُميّة المُكوّن الرئيسي للمُركّب تُساوي سُميّة أكسيد الإيثيلين الخام أو تزيد عنها. لكن استخدام مُركّبات مُنفردة قد يُتيح مجالًا لتطور مُقاومة، كما هو الحال مع المُبيدات الحشرية الكيميائية.5،6 لذلك، ينصبّ التركيز حاليًا على تحضير مُخاليط من مُركّبات أساسها أكسيد الإيثيلين لتحسين فعالية المُبيدات الحشرية وتقليل احتمالية ظهور مُقاومة في مجموعات الآفات المُستهدفة. قد تُظهر المركبات النشطة الفردية الموجودة في الزيوت العطرية تأثيرات تآزرية أو مضادة عند استخدامها معًا، مما يعكس النشاط العام للزيت العطري، وهي حقيقة أكدتها الدراسات التي أجراها باحثون سابقون7،8. يشمل برنامج مكافحة النواقل أيضًا الزيوت العطرية ومكوناتها. وقد دُرست فعالية الزيوت العطرية في إبادة البعوض على نطاق واسع على بعوض الكيولكس والأنوفيلة. وحاولت العديد من الدراسات تطوير مبيدات حشرية فعالة من خلال الجمع بين نباتات مختلفة ومبيدات حشرية صناعية مستخدمة تجاريًا لزيادة السمية الكلية وتقليل الآثار الجانبية9. إلا أن دراسات هذه المركبات ضد بعوض الزاعجة المصرية لا تزال نادرة. وقد ساعد التقدم في العلوم الطبية وتطوير الأدوية واللقاحات في مكافحة بعض الأمراض المنقولة بالنواقل. إلا أن وجود أنماط مصلية مختلفة من الفيروس، الذي ينتقل عن طريق بعوض الزاعجة المصرية، أدى إلى فشل برامج التطعيم. لذلك، عند ظهور مثل هذه الأمراض، تُعدّ برامج مكافحة النواقل الخيار الوحيد لمنع انتشار المرض. في السيناريو الحالي، تُعد السيطرة على بعوضة الزاعجة المصرية (Aedes aegypti) أمرًا بالغ الأهمية، إذ إنها ناقل رئيسي لمختلف الفيروسات وأنماطها المصلية المسببة لحمى الضنك، وزيكا، وحمى الضنك النزفية، والحمى الصفراء، وغيرها. والجدير بالذكر أن عدد حالات الإصابة بجميع الأمراض المنقولة بالنواقل تقريبًا ببعوضة الزاعجة المصرية يتزايد كل عام في مصر، ويتزايد في جميع أنحاء العالم. لذلك، وفي هذا السياق، ثمة حاجة ملحة إلى وضع تدابير مكافحة صديقة للبيئة وفعالة لتجمعات بعوضة الزاعجة المصرية. ومن بين المرشحين المحتملين في هذا الصدد الزيوت العطرية ومركباتها المكونة ومجموعاتها. لذلك، سعت هذه الدراسة إلى تحديد مجموعات تآزرية فعالة من مركبات الزيوت العطرية النباتية الرئيسية من خمسة نباتات ذات خصائص مبيدة للحشرات (وهي النعناع والريحان المقدس والأوكالبتوس المرقط وكبريت الثوم والميلاليوكا) ضد بعوضة الزاعجة المصرية.
أظهرت جميع الزيوت العطرية المختارة نشاطًا مُحتملًا مُبيدًا لليرقات ضد بعوضة الزاعجة المصرية، بتركيز مميت ٥٠٪ على مدار ٢٤ ساعة، تراوح بين ٠.٤٢ و١٦٣.٦٥ جزء في المليون. سُجِّل أعلى نشاط مُبيد لليرقات في زيت النعناع (Mp) بتركيز مميت ٥٠٪ بلغ ٠.٤٢ جزء في المليون على مدار ٢٤ ساعة، يليه زيت الثوم (As) بتركيز مميت ٥٠٪ بلغ ١٦.١٩ جزء في المليون على مدار ٢٤ ساعة (الجدول ١).
باستثناء زيت الأوكالبتوس العطري (Ocimum Sainttum) وزيت الأوكالبتوس العطري (Os EO)، أظهرت جميع الزيوت العطرية الأربعة الأخرى المُفحصة تأثيراتٍ واضحةً مُبيدةً للحساسية، حيث تراوحت قيم التركيز المميت للنصف (LC50) بين 23.37 و120.16 جزء في المليون خلال فترة التعرض التي استمرت 24 ساعة. كان زيت الأوكالبتوس العطري (Cl) الأكثر فعاليةً في قتل البالغين، حيث بلغت قيمة التركيز المميت للنصف (LC50) 23.37 جزء في المليون خلال 24 ساعة من التعرض، يليه زيت الأوكالبتوس المبقع (Em) الذي بلغت قيمة التركيز المميت للنصف (LC50) 101.91 جزء في المليون (الجدول 1). من ناحية أخرى، لم تُحدد قيمة التركيز المميت للنصف (LC50) لزيت الأوكالبتوس بعد، حيث سُجل أعلى معدل وفيات بنسبة 53% عند أعلى جرعة (الشكل التكميلي 3).
تم تحديد واختيار المركبين الرئيسيين في كل زيت عطري بناءً على نتائج قاعدة بيانات مكتبة المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا، ونسبة مساحة كروماتوغرام الغاز، ونتائج أطياف الطيف الكتلي (الجدول 2). بالنسبة لزيت العطري الزرنيخ، كانت المركبات الرئيسية المحددة هي ثنائي كبريتيد ثنائي الأليل وثلاثي كبريتيد ثنائي الأليل؛ وبالنسبة لزيت العطري الماغنسيوم، كانت المركبات الرئيسية المحددة هي الكارفون والليمونين؛ وبالنسبة لزيت العطري الماغنسيوم، كانت المركبات الرئيسية المحددة هي اليوديسمول والأوكالبتول؛ وبالنسبة لزيت العطري الماغنسيوم، كانت المركبات الرئيسية المحددة هي الأوجينول وميثيل الأوجينول، وبالنسبة لزيت العطري الكلور، كانت المركبات الرئيسية المحددة هي الأوجينول وألفا بينين (الشكل 1، الأشكال التكميلية 5-8، الجدول التكميلي 1-5).
نتائج مطيافية الكتلة للتربينويدات الرئيسية للزيوت العطرية المختارة (ألفا ثنائي كبريتيد الأليل؛ ب- ثنائي كبريتيد الأليل؛ ج- يوجينول؛ د- ميثيل يوجينول؛ إي- ليمونين؛ ف- سيبرون عطري؛ ج- ألفا- بينين؛ إتش- سينول؛ ر- يودامول).
تم تحديد تسعة مركبات (ثنائي كبريتيد الأليل، ثلاثي كبريتيد الأليل، يوجينول، ميثيل يوجينول، كارفون، ليمونين، أوكالبتول، يوديسمول، ألفا بينين) كمركبات فعالة تُمثل المكونات الرئيسية لزيت الأوكالبتوس العطري، وقد خضعت لاختبارات حيوية فردية ضد بعوضة الزاعجة المصرية في مراحلها اليرقية. أظهر مركب يوديسمول أعلى نشاط قاتل لليرقات، حيث بلغت قيمة التركيز المميت للنصف (LC50) 2.25 جزء في المليون بعد 24 ساعة من التعرض. كما وُجد أن لمركبي ثنائي كبريتيد الأليل وثلاثي كبريتيد الأليل تأثيرات قاتلة محتملة لليرقات، بجرعات متوسطة دون مميتة تتراوح بين 10 و20 جزء في المليون. لوحظ نشاطٌ مُعتدلٌ مُبيدٌ لليرقات مُجددًا لمركبات الأوجينول والليمونين والأوكالبتول، حيث بلغت قيم التركيز المميت للنصف (LC50) 63.35 جزء في المليون، و139.29 جزء في المليون، و181.33 جزء في المليون بعد 24 ساعة، على التوالي (الجدول 3). ومع ذلك، لم يُلاحظ أيُّ تأثيرٍ يُذكر على اليرقات لميثيل الأوجينول والكارفون حتى عند أعلى الجرعات، ولذلك لم تُحسب قيم التركيز المميت للنصف (الجدول 3). بلغ متوسط ​​التركيز المميت لمبيد اليرقات الاصطناعي "تيميفوس" 0.43 جزء في المليون ضد بعوضة الزاعجة المصرية على مدار 24 ساعة من التعرض (الجدول 3، الجدول المُكمل 6).
تم تحديد سبعة مركبات (ثنائي كبريتيد الأليل، وثنائي كبريتيد الأليل، والأوكالبتول، وألفا بينين، واليوديسمول، والليمونين، والكارفون) كمركبات رئيسية فعالة في زيت الأوكالبتوس العطري، واختُبرت كل منها على حدة ضد بعوض الزاعجة المصرية البالغ. ووفقًا لتحليل انحدار بروبيت، وُجد أن اليوديسمول يتمتع بأعلى قدرة فعّالة، حيث بلغت قيمة التركيز المميت للنصف (LC50) 1.82 جزء في المليون، يليه الأوكالبتول بقيمة تركيز مميت للنصف (LC50) بلغت 17.60 جزء في المليون عند مدة تعرض 24 ساعة. أما المركبات الخمسة المتبقية التي تم اختبارها، فقد كانت ضارة بشكل معتدل على البالغين، حيث تراوحت قيم التركيز المميت للنصف (LC50) بين 140.79 و737.01 جزء في المليون (الجدول 3). كان الملاثيون العضوي الفسفوري الاصطناعي أقل فعالية من اليوديسمول وأعلى من المركبات الستة الأخرى، مع قيمة LC50 تبلغ 5.44 جزء في المليون على مدى فترة التعرض التي استمرت 24 ساعة (الجدول 3، الجدول التكميلي 6).
تم اختيار سبعة مركبات رصاصية قوية ومادة تاميفوسات الفوسفورية العضوية لصياغة تركيبات ثنائية بجرعات LC50 بنسبة 1:1. تم تحضير 28 تركيبة ثنائية واختبار فعاليتها في قتل اليرقات ضد بعوضة الزاعجة المصرية. وُجد أن تسع تركيبات منها متآزرة، و14 تركيبة مضادة، وخمس تركيبات غير قاتلة لليرقات. من بين التركيبات المتآزرة، كان مزيج ثنائي كبريتيد الأليل والتيموفول الأكثر فعالية، حيث لوحظت نسبة نفوق 100% بعد 24 ساعة (الجدول 4). وبالمثل، أظهرت خلطات الليمونين مع ثنائي كبريتيد الأليل والأوجينول مع الثيميثفوس إمكانات جيدة، حيث لوحظت نسبة نفوق لليرقات بلغت 98.3% (الجدول 5). أظهرت التركيبات الأربع المتبقية، وهي يوديسمول مع أوكالبتول، يوديسمول مع ليمونين، يوكالبتول مع ألفا بينين، ألفا بينين مع تيميفوس، فعاليةً ملحوظةً في إبادة اليرقات، حيث تجاوزت معدلات الوفيات المُلاحظة 90%. ويتراوح معدل الوفيات المتوقع بين 60% و75% (الجدول 4). ومع ذلك، أظهر مزيج الليمونين مع ألفا بينين أو الأوكالبتوس تفاعلاتٍ مُضادة. وبالمثل، وُجد أن لمخاليط تيميفوس مع الأوجينول أو الأوكالبتوس أو اليوديسمول أو ثنائي الأليل ثلاثي الكبريتيد تأثيراتٍ مُضادة. وبالمثل، فإن مزيج ثنائي الأليل ثنائي الكبريتيد وثنائي الأليل ثلاثي الكبريتيد، ومزيج أيٍّ من هذه المركبات مع اليوديسمول أو الأوجينول، تأثيرًا مُضادًا في إبادة اليرقات. وقد تم الإبلاغ أيضًا عن حدوث تضاد مع الجمع بين يوديسمول مع الأوجينول أو ألفا بينين.
من بين جميع الخلطات الثنائية الـ 28 التي اختُبرت لنشاطها الحمضي لدى البالغين، كانت 7 خلطات متآزرة، و6 خلطات بلا تأثير، و15 خلطة مضادة. وُجد أن خلطات اليوديسمول مع الأوكالبتوس والليمونين مع الكارفون أكثر فعالية من الخلطات التآزرية الأخرى، حيث بلغت معدلات الوفيات بعد 24 ساعة 76% و100% على التوالي (الجدول 5). ولوحظ أن الملاثيون يُظهر تأثيرًا تآزريًا مع جميع خلطات المركبات باستثناء الليمونين وثنائي أليل ثلاثي الكبريتيد. من ناحية أخرى، وُجد تآزر بين ثنائي أليل ثنائي الكبريتيد وثنائي أليل ثلاثي الكبريتيد وخلط أي منهما مع الأوكالبتوس، أو الأوكالبتول، أو الكارفون، أو الليمونين. وبالمثل، أظهرت تركيبات ألفا-بينين مع يوديسمول أو ليمونين، وأوكاليبتول مع كارفون أو ليمونين، وليمونين مع يوديسمول أو ملاثيون تأثيرات مضادة لليرقات. أما التركيبات الست المتبقية، فلم يُلاحظ فرق كبير بين معدل الوفيات المتوقع والمُلاحظ (الجدول 5).
بناءً على التأثيرات التآزرية والجرعات دون المميتة، تم اختيار سميتها القاتلة لليرقات ضد عدد كبير من بعوض الزاعجة المصرية واختبارها لاحقًا. أظهرت النتائج أن نسبة نفوق اليرقات الملحوظة باستخدام التركيبات الثنائية: يوجينول-ليمونين، وثنائي أليل ثنائي كبريتيد-ليمونين، وثنائي أليل ثنائي كبريتيد-تايمفوس كانت 100%، بينما كانت نسبة نفوق اليرقات المتوقعة 76.48%، و72.16%، و63.4% على التوالي (الجدول 6). كان مزيج الليمونين واليوديسمول أقل فعالية نسبيًا، حيث لوحظ نفوق يرقات بنسبة 88% خلال فترة التعرض التي استمرت 24 ساعة (الجدول 6). باختصار، أظهرت التركيبات الثنائية الأربعة المختارة أيضًا تأثيرات قاتلة لليرقات التآزرية ضد بعوض الزاعجة المصرية عند تطبيقها على نطاق واسع (الجدول 6).
تم اختيار ثلاث تركيبات تآزرية لاختبار مبيدات الحشرات البالغة للسيطرة على أعداد كبيرة من بعوض الزاعجة المصرية البالغة. لاختيار تركيبات لاختبارها على مستعمرات الحشرات الكبيرة، ركزنا أولاً على أفضل تركيبتين تآزريتين من التربين، وهما كارفون مع ليمونين وأوكالبتول مع يوديسمول. ثانياً، تم اختيار أفضل تركيبة تآزرية من مزيج مالاثيون الفوسفات العضوي الاصطناعي مع التربينويدات. نعتقد أن تركيبة الملاثيون واليوديسمول هي التركيبة الأفضل لاختبارها على مستعمرات الحشرات الكبيرة نظرًا لأعلى معدل وفيات مُلاحظ وقيم LC50 منخفضة جدًا للمكونات المرشحة. يُظهر الملاثيون تآزرًا عند استخدامه مع ألفا بينين، وثنائي كبريتيد ثنائي الأليل، والأوكالبتوس، والكارفون، واليوديسمول. ولكن عند النظر إلى قيم LC50، فإن يوديسمول لديه أقل قيمة (2.25 جزء في المليون). بلغت قيم LC50 المحسوبة للملاثيون، وألفا بينين، وثنائي كبريتيد الأليل، والأوكالبتول، والكارفون 5.4، و716.55، و166.02، و17.6، و140.79 جزء في المليون على التوالي. تشير هذه القيم إلى أن مزيج الملاثيون واليوديسمول هو المزيج الأمثل من حيث الجرعة. أظهرت النتائج أن مزيج الكارفون مع الليمونين واليوديسمول مع الملاثيون حقق معدل وفيات ملحوظًا بنسبة 100%، مقارنةً بمعدل وفيات متوقع يتراوح بين 61% و65%. أظهر مزيج آخر، وهو اليوديسمول مع الأوكالبتول، معدل وفيات بلغ 78.66% بعد 24 ساعة من التعرض، مقارنةً بمعدل وفيات متوقع يبلغ 60%. أظهرت التركيبات الثلاث المختارة تأثيرات تآزرية حتى عند تطبيقها على نطاق واسع ضد بعوض الزاعجة المصرية البالغ (الجدول 6).
في هذه الدراسة، أظهرت زيوت عطرية نباتية مختارة، مثل Mp وAs وOs وEm وCl، تأثيرات قاتلة واعدة على مراحل اليرقات والبالغات من بعوضة Aedes aegypti. أظهر زيت Mp EO أعلى نشاط قاتل لليرقات بقيمة LC50 بلغت 0.42 جزء في المليون، يليه زيت As وOs وEm بقيمة LC50 أقل من 50 جزء في المليون بعد 24 ساعة. تتوافق هذه النتائج مع دراسات سابقة أجريت على البعوض وأنواع أخرى من الذباب ثنائي الأجنحة. 10،11،12،13،14. على الرغم من أن فعالية Cl القاتلة لليرقات أقل من الزيوت العطرية الأخرى، بقيمة LC50 تبلغ 163.65 جزء في المليون بعد 24 ساعة، إلا أن قدرته على قتل اليرقات هي الأعلى بقيمة LC50 تبلغ 23.37 جزء في المليون بعد 24 ساعة. أظهرت الزيوت العطرية Mp وAs وEm أيضًا إمكانات جيدة في إبادة الحساسية بقيم LC50 في نطاق 100-120 جزء في المليون عند 24 ساعة من التعرض، ولكنها كانت أقل نسبيًا من فعاليتها في إبادة اليرقات. من ناحية أخرى، أظهرت الزيوت العطرية Os تأثيرًا مبيدًا للحساسية ضئيلًا حتى عند أعلى جرعة علاجية. وبالتالي، تشير النتائج إلى أن سمية أكسيد الإيثيلين للنباتات قد تختلف اعتمادًا على المرحلة التنموية للبعوض15. كما تعتمد أيضًا على معدل اختراق الزيوت العطرية لجسم الحشرة وتفاعلها مع إنزيمات مستهدفة محددة وقدرة البعوض على إزالة السموم في كل مرحلة نمو16. أظهر عدد كبير من الدراسات أن المركب المكون الرئيسي هو عامل مهم في النشاط البيولوجي لأكسيد الإيثيلين، لأنه يمثل غالبية المركبات الإجمالية3،12،17،18. لذلك، أخذنا في الاعتبار مركبين رئيسيين في كل زيت عطري. بناءً على نتائج كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة (GC-MS)، حُدد ثنائي كبريتيد ثنائي الأليل وثلاثي كبريتيد ثنائي الأليل كمركبين رئيسيين في زيت الأوكالبتوس العطري، وهو ما يتوافق مع التقارير السابقة19،20،21. على الرغم من أن التقارير السابقة أشارت إلى أن المنثول كان أحد مركباته الرئيسية، فقد حُدد الكارفون والليمونين مرة أخرى كمركبين رئيسيين في زيت الأوكالبتوس العطري Mp22،23. أظهر تحليل تركيب زيت الأوكالبتوس العطري أن الأوجينول وميثيل الأوجينول هما المركبان الرئيسيان، وهو ما يتوافق مع نتائج باحثين سابقين16،24. أُفيد بأن الأوكاليبتول والأوكالبتول هما المركبان الرئيسيان الموجودان في زيت أوراق الأوكالبتوس، وهو ما يتوافق مع نتائج بعض الباحثين25،26 ولكنه يتعارض مع نتائج أولالاد وآخرون27. لوحظت هيمنة السينول وألفا بينين في زيت الميلاليوكا العطري، وهو ما يتوافق مع الدراسات السابقة28،29. وقد تم الإبلاغ عن اختلافات داخل النوع في تركيب وتركيز الزيوت العطرية المستخرجة من نفس الأنواع النباتية في مواقع مختلفة، كما لوحظت في هذه الدراسة، والتي تتأثر بظروف نمو النبات الجغرافية، ووقت الحصاد، ومرحلة النمو، أو عمر النبات. وظهور الأنماط الكيميائية، وما إلى ذلك. 22، 30، 31، 32. ثم تم شراء المركبات الرئيسية المحددة واختبارها لمعرفة آثارها القاتلة لليرقات وتأثيراتها على بعوض الزاعجة المصرية البالغ. وأظهرت النتائج أن النشاط القاتل لليرقات لثنائي كبريتيد الأليل كان مماثلاً لنشاط أكسيد الزيوت العطرية الخام. ولكن نشاط ثلاثي كبريتيد الأليل أعلى من أكسيد الزيوت العطرية. وتتشابه هذه النتائج مع تلك التي حصل عليها كيمباريس وآخرون. 33 على بعوضة الكيولكس الفلبينية. ومع ذلك، لم يُظهر هذان المركبان نشاطًا قاتلًا جيدًا ضد البعوض المستهدف، وهو ما يتفق مع نتائج بلاتا-رويدا وآخرون. 34 على بعوضة تينبريو موليتور. زيت أوكسي إيل فعّال ضد المرحلة اليرقية لبعوضة الزاعجة المصرية (Aedes aegypti)، ولكنه ليس فعالاً ضد المرحلة البالغة. وقد ثبت أن النشاط القاتل لليرقات للمركبات الرئيسية الفردية أقل من نشاط زيت أوكسي إيل الخام. وهذا يدل على دور المركبات الأخرى وتفاعلاتها في أكسيد الإيثيلين الخام. يتميز ميثيل يوجينول وحده بنشاط ضئيل، بينما يتميز يوجينول وحده بنشاط قاتل لليرقات معتدل. يؤكد هذا الاستنتاج، من جهة،35،36، ومن جهة أخرى، يتناقض مع استنتاجات باحثين سابقين37،38. قد تؤدي الاختلافات في المجموعات الوظيفية للأوجينول والميثيل يوجينول إلى سمية مختلفة لنفس الحشرة المستهدفة39. وُجد أن لليمونين نشاطًا قاتلًا لليرقات معتدلًا، بينما كان تأثير الكارفون ضئيلًا. وبالمثل، فإن السمية المنخفضة نسبيًا لليمونين للحشرات البالغة والسمية العالية للكارفون تدعم نتائج بعض الدراسات السابقة40، ولكنها تتناقض مع دراسات أخرى41. قد يزيد وجود الروابط المزدوجة في كل من المواضع الحلقية الداخلية والخارجية من فوائد هذه المركبات كمبيدات لليرقات3،41، بينما قد يُظهر الكارفون، وهو كيتون يحتوي على ذرات ألفا وبيتا كربون غير مشبعة، احتمالية أعلى للسمية لدى البالغين42. ومع ذلك، فإن الخصائص الفردية لليمونين والكارفون أقل بكثير من إجمالي Mp للزيوت العطرية (الجدول 1، الجدول 3). من بين التربينويدات المختبرة، وُجد أن اليوديسمول يتمتع بأعلى نشاط مبيد لليرقات والبالغين بقيمة LC50 أقل من 2.5 جزء في المليون، مما يجعله مركبًا واعدًا لمكافحة بعوض الزاعجة. أداءه أفضل من أداء كامل EO Em، على الرغم من أن هذا لا يتوافق مع نتائج تشنغ وآخرون40. اليوديسمول هو سيسكيتيربين ذو وحدتي إيزوبرين، وهو أقل تطايرًا من أحاديات التربين المؤكسدة مثل الأوكالبتوس، وبالتالي لديه إمكانات أكبر كمبيد للآفات. يتمتع الأوكالبتول نفسه بنشاط أكبر في إبادة الحشرات البالغة منه في إبادة اليرقات، وتدعم نتائج الدراسات السابقة هذا الرأي وتدحضه في آنٍ واحد. يُقارن هذا النشاط وحده تقريبًا بنشاط زيت الأوكالبتول العطري بأكمله. كما أن أحادي التربين ثنائي الحلقة، ألفا بينين، له تأثير أقل على حشرات الزاعجة المصرية البالغة من تأثيره في إبادة اليرقات، وهو عكس تأثير زيت الأوكالبتول العطري بأكمله. يتأثر النشاط الكلي للتربينويدات كمبيد للحشرات بمدى محبتها للدهون، وتقلبها، وتفرع ذراتها الكربونية، ومساحة إسقاطها، ومساحة سطحها، ومجموعاتها الوظيفية، ومواقعها. قد تعمل هذه المركبات عن طريق تدمير تراكمات الخلايا، وعرقلة النشاط التنفسي، وتعطيل انتقال النبضات العصبية، وما إلى ذلك. 47 وُجد أن مركب تيميفوس، وهو فوسفات عضوي صناعي، يتمتع بأعلى نشاط في إبادة اليرقات بقيمة LC50 تبلغ 0.43 جزء في المليون، وهو ما يتوافق مع بيانات ليك - Utala48. سُجِّل نشاطٌ بالغٌ لمالاثيون الفوسفوري العضوي الاصطناعي عند تركيز 5.44 جزء في المليون. وعلى الرغم من أن هذين المركبين الفوسفوريين العضويين أظهرا استجاباتٍ إيجابيةً ضد سلالاتٍ مختبريةٍ من بعوض الزاعجة المصرية، فقد سُجِّلت مقاومةٌ لهذين المركبين في مناطقَ مختلفةٍ من العالم49. ومع ذلك، لم تُسجَّل أيُّ تقاريرٍ مماثلةٍ عن ظهور مقاومةٍ للأدوية العشبية50. ولذلك، تُعتبر النباتات بدائلَ محتملةً للمبيدات الكيميائية في برامج مكافحة النواقل.
تم اختبار التأثير القاتل لليرقات على 28 تركيبة ثنائية (1:1) مُحضرة من تربينويدات قوية وتربينويدات مع ثيميثفوس، ووُجد أن 9 تركيبات منها كانت متآزرة، و14 تركيبة مضادة، و5 تركيبات مضادة. ولم يُلاحظ أي تأثير. من ناحية أخرى، في اختبار الفعالية الحيوية للبالغين، وُجد أن 7 تركيبات كانت متآزرة، و15 تركيبة مضادة، و6 تركيبات لم تُسجل أي تأثير. قد يُعزى سبب إحداث تركيبات معينة تأثيرًا تآزريًا إلى تفاعل المركبات المرشحة في وقت واحد في مسارات مهمة مختلفة، أو إلى التثبيط المتتالي لإنزيمات رئيسية مختلفة في مسار بيولوجي معين. وُجد أن مزيج الليمونين مع ثنائي كبريتيد الأليل، أو الأوكالبتوس، أو الأوجينول يُحدث تأثيرًا تآزريًا في التطبيقات الصغيرة والكبيرة (الجدول 6)، بينما وُجد أن مزيجه مع الأوكالبتوس أو ألفا-بينين يُحدث تأثيرات مُضادة لليرقات. في المتوسط، يبدو أن الليمونين يُحدث تأثيرًا تآزريًا جيدًا، ربما بسبب وجود مجموعات الميثيل، ونفاذه الجيد إلى الطبقة القرنية، واختلاف آلية عمله52،53. وقد أُفيد سابقًا أن الليمونين قد يُسبب تأثيرات سامة عن طريق اختراقه لبشرة الحشرات (سمية التلامس)، أو التأثير على الجهاز الهضمي (مضاد للتغذية)، أو التأثير على الجهاز التنفسي (نشاط التبخير)،54 بينما قد تؤثر فينيل بروبانويدات، مثل الأوجينول، على الإنزيمات الأيضية55. لذلك، قد يُزيد مزيج المركبات ذات آليات العمل المختلفة من التأثير المميت الكلي للخليط. وُجد أن الأوكاليبتول يتآزر مع ثنائي كبريتيد الأليل، أو الأوكاليبتوس، أو ألفا-بينين، إلا أن تركيبات أخرى مع مركبات أخرى كانت إما غير قاتلة لليرقات أو مضادة لها. أظهرت الدراسات المبكرة أن للأوكاليبتول نشاطًا مثبطًا على إنزيم الأسيتيل كولينستراز (AChE)، بالإضافة إلى مستقبلات الأوكتامين وحمض غاما أمينوبوتيريك (GABA)56. وبما أن أحاديات التربين الحلقية، والأوكاليبتول، والأوجينول، وغيرها، قد تتشابه في آلية عملها مع نشاطها العصبي السمي، 57 مما يقلل من آثارها المشتركة من خلال التثبيط المتبادل. وبالمثل، وُجد أن تركيبة التيميفوس مع ثنائي كبريتيد الأليل، وألفا-بينين، والليمونين تتآزر، مما يدعم التقارير السابقة عن التأثير التآزري بين المنتجات العشبية والفوسفات العضوية الاصطناعية58.
وُجد أن لمزيج اليوديسمول والأوكالبتول تأثيرًا تآزريًا على مراحل اليرقات والبالغات من بعوضة الزاعجة المصرية، ربما بسبب اختلاف آليات عملهما نتيجةً لاختلاف تركيبهما الكيميائي. قد يؤثر اليوديسمول (أحد السيسكيتيربين) على الجهاز التنفسي 59، وقد يؤثر الأوكالبتول (أحد الأحادي التربين) على الأسيتيل كولينستريز 60. قد يعزز التعرض المشترك للمكونات لموقعين مستهدفين أو أكثر التأثير المميت الكلي للمزيج. في الاختبارات الحيوية للمواد البالغة، وُجد أن الملاثيون يتآزر مع الكارفون أو الأوكالبتول أو الأوكالبتول أو ثنائي كبريتيد الأليل أو ألفا بينين، مما يشير إلى أنه يتآزر مع إضافة الليمونين وثنائي كبريتيد الأليل. مرشحون جيدون لمبيدات الحساسية التآزرية لمجموعة مركبات التربين بأكملها، باستثناء ثلاثي كبريتيد الأليل. أفاد ثانغام وكاثيريسان61 أيضًا بنتائج مماثلة للتأثير التآزري للملاثيون مع المستخلصات العشبية. قد تُعزى هذه الاستجابة التآزرية إلى التأثيرات السامة المشتركة للملاثيون والمواد الكيميائية النباتية على إنزيمات إزالة السموم من الحشرات. تعمل الفوسفات العضوية، مثل الملاثيون، عادةً عن طريق تثبيط إستريزات السيتوكروم بي450 وأحادي أوكسيجيناز62،63،64. لذلك، فإن الجمع بين الملاثيون وآليات العمل هذه، والتربينات ذات آليات العمل المختلفة، قد يعزز التأثير المميت العام على البعوض.
من ناحية أخرى، يشير التضاد إلى أن المركبات المختارة أقل نشاطًا عند دمجها معًا من كل مركب على حدة. قد يكون سبب التضاد في بعض التركيبات هو أن أحد المركبات يعدل سلوك المركب الآخر عن طريق تغيير معدل الامتصاص أو التوزيع أو الأيض أو الإخراج. اعتبر الباحثون الأوائل أن هذا هو سبب التضاد في تركيبات الأدوية. الجزيئات الآلية المحتملة 65. وبالمثل، قد تكون الأسباب المحتملة للتضاد مرتبطة بآليات عمل مماثلة، وتنافس المركبات المكونة على نفس المستقبل أو موقع الهدف. في بعض الحالات، قد يحدث أيضًا تثبيط غير تنافسي للبروتين المستهدف. في هذه الدراسة، أظهر مركبان عضويان من الكبريت، وهما ثنائي كبريتيد ثنائي الأليل وثلاثي كبريتيد ثنائي الأليل، تأثيرات تضاد، ربما بسبب التنافس على نفس موقع الهدف. وبالمثل، أظهر مركبا الكبريت هذين تأثيرات تضاد ولم يكن لهما أي تأثير عند دمجهما مع يوديسمول وألفا بينين. اليوديسمول وألفا-بينين حلقان بطبيعتهما، بينما ثنائي كبريتيد ثنائي الأليل وثلاثي كبريتيد ثنائي الأليل أليفاتيان بطبيعتهما. بناءً على التركيب الكيميائي، يُفترض أن يزيد اتحاد هذه المركبات من النشاط المميت الإجمالي نظرًا لاختلاف مواقعها المستهدفة عادةً34،47، ولكننا وجدنا تجريبيًا تضادًا، والذي قد يُعزى إلى دور هذه المركبات في بعض أنظمة الكائنات الحية غير المعروفة نتيجةً للتفاعل. وبالمثل، أنتج اتحاد السينول وألفا-بينين استجابات تضاد، على الرغم من أن الباحثين أفادوا سابقًا بأن للمركبين أهداف عمل مختلفة47،60. ونظرًا لأن كلا المركبين أحاديان حلقان، فقد تكون هناك بعض مواقع الاستهداف المشتركة التي قد تتنافس على الارتباط وتؤثر على السمية الإجمالية للأزواج التركيبية المدروسة.
بناءً على قيم LC50 ومعدل الوفيات الملحوظ، تم اختيار أفضل تركيبتين تآزريتين من التربين، وهما أزواج الكارفون + الليمونين والأوكالبتول + يوديسمول، بالإضافة إلى الملاثيون العضوي الفسفوري الاصطناعي مع التربينات. تم اختبار التركيبة التآزرية المثلى لمركبات الملاثيون + يوديسمول في اختبار حيوي لمبيد حشري بالغ. استهدف مستعمرات حشرية كبيرة للتأكد من قدرة هذه التركيبات الفعالة على العمل ضد أعداد كبيرة من الأفراد على مساحات تعرض كبيرة نسبيًا. تُظهر جميع هذه التركيبات تأثيرًا تآزريًا ضد أسراب كبيرة من الحشرات. تم الحصول على نتائج مماثلة لتركيبة مبيد يرقات تآزرية مثالية تم اختبارها ضد أعداد كبيرة من يرقات الزاعجة المصرية. وبالتالي، يمكن القول إن التركيبة التآزرية الفعالة لمبيدات اليرقات والبالغات من مركبات الزيوت العطرية النباتية هي مرشح قوي ضد المواد الكيميائية الاصطناعية الموجودة ويمكن استخدامها بشكل أكبر لمكافحة تجمعات الزاعجة المصرية. وبالمثل، يُمكن استخدام تركيبات فعّالة من مبيدات اليرقات أو مبيدات البالغين الاصطناعية مع التربينات لتقليل جرعات الثيميثفوس أو الملاثيون المُعطاة للبعوض. قد تُوفر هذه التركيبات التآزرية القوية حلولاً للدراسات المستقبلية حول تطور مقاومة الأدوية لدى بعوض الزاعجة.
جُمعت بيضات بعوضة الزاعجة المصرية من المركز الإقليمي للبحوث الطبية في ديبروجاره، التابع للمجلس الهندي للبحوث الطبية، وحُفظت في درجة حرارة مُتحكم بها (28 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة (85 ± 5%) في قسم علم الحيوان بجامعة جواهاتي، وذلك في ظل الظروف التالية: وصف أريفولي وآخرون. بعد الفقس، أُطعمت اليرقات طعامًا خاصًا بها (مسحوق بسكويت الكلاب والخميرة بنسبة 3:1)، وأُطعمت البالغة محلول جلوكوز 10%. ابتداءً من اليوم الثالث بعد ظهورها، سُمح لإناث البعوض البالغة بمص دم فئران بيضاء. انقع ورق الترشيح في كوب من الماء، ثم ضعه في قفص وضع البيض.
عينات نباتية مختارة، وهي أوراق الكينا (الآسية)، والريحان المقدس (الشفوية)، والنعناع (الشفوية)، والميلاليوكا (الآسية)، وأبصال الثوم (الأماريلية). جُمعت من جواهاتي، وحددها قسم النبات بجامعة جواهاتي. خضعت عينات النباتات المجمعة (500 غرام) للتقطير المائي باستخدام جهاز كليفنغر لمدة 6 ساعات. جُمعت الزيوت العطرية المستخلصة في قوارير زجاجية نظيفة، وحُفظت عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمزيد من الدراسة.
دُرست السمية القاتلة لليرقات باستخدام إجراءات منظمة الصحة العالمية القياسية المعدلة قليلاً 67. استخدم DMSO كمستحلب. تم اختبار كل تركيز من الزيوت العطرية في البداية عند 100 و 1000 جزء في المليون، مع تعريض 20 يرقة في كل تكرار. بناءً على النتائج، تم تطبيق نطاق تركيز وتم تسجيل الوفيات من ساعة واحدة إلى 6 ساعات (بفاصل ساعة واحدة)، وبعد 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من العلاج. تم تحديد التركيزات دون المميتة (LC50) بعد 24 و 48 و 72 ساعة من التعرض. تم اختبار كل تركيز في ثلاث نسخ مع ضابط سلبي واحد (ماء فقط) وضوابط إيجابية واحدة (ماء معالج بـ DMSO). إذا حدث تعذر وموت أكثر من 10٪ من يرقات المجموعة الضابطة، تُكرر التجربة. إذا كان معدل الوفيات في المجموعة الضابطة بين 5-10٪، فاستخدم صيغة تصحيح أبوت 68.
الطريقة التي وصفها رامار وآخرون. 69 استُخدمت في اختبار حيوي للبالغين ضد بعوض الزاعجة المصرية باستخدام الأسيتون كمذيب. تم اختبار كل زيت عطري في البداية ضد بعوض الزاعجة المصرية البالغ بتركيزات 100 و1000 جزء في المليون. ضع 2 مل من كل محلول مُجهز على رقم واتمان. قطعة واحدة من ورق الترشيح (مقاس 12 × 15 سم2) واترك الأسيتون يتبخر لمدة 10 دقائق. تم استخدام ورق الترشيح المعالج بـ 2 مل فقط من الأسيتون كعنصر تحكم. بعد تبخر الأسيتون، يتم وضع ورق الترشيح المعالج وورقة الترشيح الضابطة في أنبوب أسطواني (عمق 10 سم). تم نقل عشرة بعوض غير متغذى على الدم تتراوح أعمارها بين 3 إلى 4 أيام إلى ثلاث نسخ من كل تركيز. بناءً على نتائج الاختبارات الأولية، تم اختبار تركيزات مختلفة من الزيوت المختارة. سُجِّلت الوفيات بعد ساعة، ساعتين، ثلاث ساعات، أربع ساعات، خمس ساعات، ست ساعات، ٢٤ ساعة، ٤٨ ساعة، و٧٢ ساعة من إطلاق البعوض. احسب قيم LC50 لأوقات التعرض (٢٤ ساعة، ٤٨ ساعة، و٧٢ ساعة). إذا تجاوز معدل الوفيات في المجموعة الضابطة ٢٠٪، يُعاد الاختبار كاملاً. وبالمثل، إذا تجاوز معدل الوفيات في المجموعة الضابطة ٥٪، يُعاد ضبط النتائج للعينات المعالجة باستخدام صيغة أبوت.
أُجريت تقنية كروماتوغرافيا الغاز (Agilent 7890A) ومطياف الكتلة (Accu TOF GCv، Jeol) لتحليل المركبات المكونة للزيوت العطرية المختارة. زُوّد جهاز كروماتوغرافيا الغاز بكاشف FID وعمود شعري (HP5-MS). كان الغاز الحامل هو الهيليوم، وكان معدل التدفق 1 مل/دقيقة. يضبط برنامج GC نبات Allium sativum على 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M ونبات Ocimum Sainttum على 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280، وللنعناع 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280، وللكينا 20.60-1M-10-200-3M-30-280، وللأحمر لألف طبقة هم 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
تم تحديد المركبات الرئيسية لكل زيت زيتون على أساس النسبة المئوية للمساحة المحسوبة من نتائج كروماتوغرام الغاز ومطياف الكتلة (المرجعية إلى قاعدة بيانات معايير NIST 70).
تم اختيار المركبين الرئيسيين في كل زيت عطري بناءً على نتائج GC-MS، وشراء المركبين من شركة Sigma-Aldrich بنقاء 98-99% لإجراء المزيد من الاختبارات الحيوية. اختُبرت فعالية هذه المركبات في قتل اليرقات والحشرات البالغة ضد بعوضة Aedes aegypti كما هو موضح سابقًا. وحُلل مُبيد اليرقات الاصطناعي الأكثر شيوعًا، تامفوسات (Sigma Aldrich)، ودواء الملاثيون (Sigma Aldrich) للبالغين، لمقارنة فعاليتهما مع مركبات زيت عطري مختارة، باتباع نفس الإجراء.
تم تحضير خلائط ثنائية من مركبات تربين مختارة ومركبات تربين، بالإضافة إلى مركبات فوسفات عضوية تجارية (تيليفوس وملاثيون)، وذلك بخلط جرعة التركيز المميت النصفي (LC50) لكل مركب مرشح بنسبة 1:1. اختُبرت الخلائط المحضرة على مراحل اليرقات والبالغات من بعوضة الزاعجة المصرية كما هو موضح سابقًا. أُجري كل اختبار حيوي ثلاث مرات لكل خليط، وثلاث مرات للمركبات الفردية الموجودة في كل خليط. سُجِّلت نفوق الحشرات المستهدفة بعد 24 ساعة. احسب معدل النفوق المتوقع لخليط ثنائي باستخدام الصيغة التالية.
حيث E = معدل الوفيات المتوقع لبعوض الزاعجة المصرية استجابة لتركيبة ثنائية، أي الاتصال (A + B).
وُصف تأثير كل خليط ثنائي بأنه تآزري، أو مضاد، أو بلا تأثير، بناءً على قيمة χ2 المحسوبة بالطريقة التي وصفها بافلا52. احسب قيمة χ2 لكل مزيج باستخدام الصيغة التالية.
عُرِّف تأثير أي توليفة بأنه تآزري عندما تكون قيمة χ2 المحسوبة أكبر من القيمة الجدولية لدرجات الحرية المقابلة (بفاصل ثقة 95%)، وإذا وُجِد أن معدل الوفيات المرصود يتجاوز معدل الوفيات المتوقع. وبالمثل، إذا تجاوزت قيمة χ2 المحسوبة لأي توليفة القيمة الجدولية بدرجات حرية معينة، ولكن معدل الوفيات المرصود أقل من معدل الوفيات المتوقع، يُعتبر العلاج مُضادًا. وإذا كانت القيمة المحسوبة لـ χ2 في أي توليفة أقل من القيمة الجدولية لدرجات الحرية المقابلة، يُعتبر أن التوليفة عديمة التأثير.
تم اختيار ثلاثة إلى أربعة توليفات تآزرية محتملة (100 يرقة و50 فعالية قاتلة لليرقات والحشرات البالغة) لاختبارها ضد عدد كبير من الحشرات. يتبع اختبار فعالية الحشرات البالغة ما سبق. إلى جانب هذه الخلطات، تم اختبار المركبات الفردية الموجودة في الخلطات المختارة على أعداد متساوية من يرقات وحشرات الزاعجة المصرية البالغة. نسبة التركيبة هي جزء واحد من جرعة LC50 من أحد المركبات المرشحة وجزء من جرعة LC50 من المركب المكون الآخر. في اختبار فعالية الحشرات البالغة، أُذيبت المركبات المختارة في الأسيتون المذيب، ووُضعت على ورق ترشيح ملفوف في وعاء بلاستيكي أسطواني سعة 1300 سم3. تم تبخير الأسيتون لمدة 10 دقائق، ثم انطلقت الحشرات البالغة. وبالمثل، في الاختبار الحيوي القاتل لليرقات، تم أولاً إذابة جرعات من المركبات المرشحة LC50 في أحجام متساوية من DMSO ثم تم خلطها مع لتر واحد من الماء المخزن في حاويات بلاستيكية سعة 1300 سم مكعب، وتم إطلاق اليرقات.
تم إجراء تحليل احتمالي لبيانات 71 حالة وفاة مسجلة باستخدام برنامج SPSS (الإصدار 16) وبرنامج Minitab لحساب قيم LC50.