لتحقيق فعاليةمكافحة البعوضوللحد من انتشار الأمراض التي تنقلها، ثمة حاجة إلى بدائل استراتيجية ومستدامة وصديقة للبيئة للمبيدات الكيميائية. قمنا بتقييم مسحوق بذور بعض أنواع الفصيلة الكرنبية (Brassicaceae) كمصدر لمركبات إيزوثيوسيانات نباتية المنشأ، تُنتج عن طريق التحلل الإنزيمي للجلوكوزينولات غير النشطة بيولوجيًا، وذلك لاستخدامها في مكافحة بعوضة الزاعجة المصرية (Aedes 1762). مسحوق بذور منزوع الدسم من خمسة أنواع (Brassica juncea (L) Czern., 1859، Lepidium sativum L., 1753، Sinapis alba L., 1753، Thlaspi arvense L., 1753 وThlaspi arvense - ثلاثة أنواع رئيسية من التثبيط الحراري والتحلل الأنزيمي. المنتجات الكيميائية لتحديد سمية (LC50) أليل إيزوثيوسيانات، وبنزيل إيزوثيوسيانات، و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات ليرقات بعوضة الزاعجة المصرية عند التعرض لمدة 24 ساعة = 0.04 جم/120 مل ماء مقطر). قيم LC50 للخردل، والخردل الأبيض، وذيل الحصان. كانت قيم LC50 لمسحوق بذور البرسيم 0.05 و0.08 و0.05 على التوالي، مقارنةً بـ LC50 لكل من أليل إيزوثيوسيانات (19.35 جزء في المليون) و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات (55.41 جزء في المليون)، مما يشير إلى أن مسحوق بذور البرسيم كان أكثر سمية لليرقات بعد 24 ساعة من المعالجة مقارنةً بـ 0.1 غ/120 مل من الماء المقطر. تتوافق هذه النتائج مع إنتاج مسحوق بذور البرسيم. وتتوافق الكفاءة العالية لإسترات البنزيل مع قيم LC50 المحسوبة. يمكن أن يوفر استخدام مسحوق البذور طريقة فعالة لمكافحة البعوض. كما توضح هذه الدراسة فعالية مسحوق بذور الخضراوات الصليبية ومكوناته الكيميائية الرئيسية ضد يرقات البعوض، وكيف يمكن للمركبات الطبيعية الموجودة في مسحوق بذور الخضراوات الصليبية أن تكون مبيدًا واعدًا وصديقًا للبيئة لليرقات في مكافحة البعوض.
لا تزال الأمراض المنقولة بالنواقل، التي تسببها بعوضة الزاعجة، تشكل مشكلة صحية عامة عالمية رئيسية. ينتشر انتشار هذه الأمراض جغرافيًا1،2،3، ثم تعاود الظهور، مما يؤدي إلى تفشي أمراض خطيرة4،5،6،7. ويُعد انتشار الأمراض بين البشر والحيوانات (مثل حمى الشيكونغونيا، وحمى الضنك، وحمى الوادي المتصدع، والحمى الصفراء، وفيروس زيكا) غير مسبوق. فحمى الضنك وحدها تُعرّض ما يقرب من 3.6 مليار شخص لخطر الإصابة في المناطق الاستوائية، مع ما يُقدّر بنحو 390 مليون إصابة سنويًا، مما ينتج عنه ما بين 6100 و24300 حالة وفاة سنويًا8. وقد استقطب ظهور فيروس زيكا مجددًا وتفشيه في أمريكا الجنوبية اهتمامًا عالميًا واسعًا نظرًا لما يُسببه من تلف في الدماغ لدى الأطفال المولودين لأمهات مصابات2. ويتوقع كريمر وآخرون3 أن يستمر النطاق الجغرافي لبعوضة الزاعجة في التوسع، وأنه بحلول عام 2050، سيكون نصف سكان العالم مُعرّضين لخطر الإصابة بالفيروسات المنقولة بالمفصليات التي تنقلها البعوض.
باستثناء اللقاحات التي طُوّرت مؤخرًا ضد حمى الضنك والحمى الصفراء، لم تُطوّر بعد لقاحات ضد معظم الأمراض التي ينقلها البعوض9،10،11. ولا تزال اللقاحات متوفرة بكميات محدودة، وتُستخدم فقط في التجارب السريرية. وقد شكّلت مكافحة نواقل البعوض باستخدام المبيدات الحشرية الاصطناعية استراتيجيةً رئيسيةً للسيطرة على انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض12،13. ورغم فعالية هذه المبيدات في قتل البعوض، فإن استمرار استخدامها يؤثر سلبًا على الكائنات غير المستهدفة، ويُلوّث البيئة14،15،16. والأكثر إثارةً للقلق هو تزايد مقاومة البعوض للمبيدات الحشرية الكيميائية17،18،19. وقد دفعت هذه المشاكل المرتبطة بالمبيدات إلى تسريع البحث عن بدائل فعّالة وصديقة للبيئة لمكافحة نواقل الأمراض.
طُوِّرت نباتاتٌ عديدة كمصادر للمبيدات النباتية لمكافحة الآفات20،21. وتُعدّ المواد النباتية عمومًا صديقةً للبيئة لأنها قابلة للتحلل الحيوي، كما أن سميتها منخفضة أو معدومة للكائنات غير المستهدفة، كالثدييات والأسماك والبرمائيات20،22. ومن المعروف أن المستحضرات العشبية تُنتج مجموعةً متنوعةً من المركبات النشطة بيولوجيًا ذات آليات عمل مختلفة، ما يُسهم في مكافحة مراحل حياة البعوض المختلفة بفعالية23،24،25،26. وقد حظيت المركبات المشتقة من النباتات، كالزيوت العطرية والمكونات النباتية النشطة الأخرى، باهتمامٍ متزايد، ومهّدت الطريق لأدوات مبتكرة لمكافحة نواقل البعوض. وتعمل الزيوت العطرية، والتربينات الأحادية، والتربينات النصفية كمواد طاردة، ومثبطة للتغذية، ومبيدات للبيض27،28،29،30،31،32،33. وتتسبب العديد من الزيوت النباتية في موت يرقات البعوض وعذاراه وحشراته البالغة34،35،36، ما يؤثر على الجهاز العصبي والتنفسي والغدد الصماء، وغيرها من الأجهزة الحيوية المهمة للحشرات37.
قدمت دراسات حديثة رؤى ثاقبة حول الاستخدام المحتمل لنباتات الخردل وبذورها كمصدر للمركبات النشطة بيولوجيًا. وقد تم اختبار مسحوق بذور الخردل كمبيد حيوي للآفات38،39،40،41، واستُخدم كمحسن للتربة لكبح نمو الأعشاب الضارة42،43،44 ومكافحة مسببات الأمراض النباتية المنقولة بالتربة45،46،47،48،49،50، وتغذية النبات، ومكافحة الديدان الخيطية41،51،52،53،54 والآفات55،56،57،58،59،60. يُعزى النشاط المضاد للفطريات لمساحيق هذه البذور إلى مركبات واقية للنبات تُسمى إيزوثيوسيانات38،42،60. في النباتات، تُخزن هذه المركبات الواقية في خلايا النبات على شكل غلوكوزينولات غير نشطة بيولوجيًا. ومع ذلك، عندما تتضرر النباتات بسبب تغذية الحشرات أو الإصابة بمسببات الأمراض، يتم تحلل الجلوكوزينولات بواسطة إنزيم الميروسينيز إلى إيزوثيوسيانات نشطة بيولوجيًا 55،61. الإيزوثيوسيانات هي مركبات متطايرة معروفة بنشاطها المضاد للميكروبات والحشرات واسع النطاق، ويختلف تركيبها ونشاطها البيولوجي ومحتواها على نطاق واسع بين أنواع الفصيلة الصليبية 42،59،62،63.
على الرغم من أن مركبات الإيزوثيوسيانات المستخلصة من مسحوق بذور الخردل معروفة بفعاليتها كمبيدات حشرية، إلا أن البيانات المتعلقة بفعاليتها البيولوجية ضد ناقلات الأمراض المفصلية ذات الأهمية الطبية لا تزال غير كافية. فحصت دراستنا فعالية أربعة مساحيق بذور منزوعة الدسم في قتل يرقات بعوضة الزاعجة المصرية. كان الهدف من الدراسة تقييم إمكانية استخدامها كمبيدات حيوية صديقة للبيئة لمكافحة البعوض. كما تم اختبار ثلاثة مكونات كيميائية رئيسية من مسحوق البذور، وهي: إيزوثيوسيانات الأليل (AITC)، وإيزوثيوسيانات البنزيل (BITC)، و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات (4-HBITC)، وذلك لاختبار فعاليتها البيولوجية على يرقات البعوض. يُعد هذا التقرير الأول من نوعه الذي يُقيّم فعالية أربعة مساحيق بذور الكرنب ومكوناتها الكيميائية الرئيسية ضد يرقات البعوض.
تمت تربية مستعمرات مختبرية من بعوضة الزاعجة المصرية (سلالة روكفلر) عند درجة حرارة 26 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 70%، وفترة إضاءة 10 ساعات وظلام 14 ساعة. وُضعت الإناث الملقحة في أقفاص بلاستيكية (ارتفاع 11 سم وقطر 9.5 سم) وغُذيت عبر نظام تغذية بالزجاجات باستخدام دم بقري مُعالج بالسترات (HemoStat Laboratories Inc.، ديكسون، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التغذية بالدم كالمعتاد باستخدام مغذي متعدد الزجاجات ذي غشاء (Chemglass، Life Sciences LLC، فيني لاند، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) موصول بأنبوب حمام مائي دوار (HAAKE S7، Thermo-Scientific، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. تم شد غشاء من Parafilm M على قاع كل حجرة تغذية زجاجية (مساحة 154 مم²). ثم وُضع كل مغذي على الشبكة العلوية التي تغطي القفص الذي يحتوي على الأنثى الملقحة. أُضيف ما يقارب 350-400 ميكرولتر من دم الأبقار إلى قمع تغذية زجاجي باستخدام ماصة باستور (Fisherbrand، Fisher Scientific، Waltham، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتُركت الديدان البالغة لتصفية الدم لمدة ساعة على الأقل. ثم أُعطيت الإناث الحوامل محلول سكروز بنسبة 10%، وسُمح لها بوضع البيض على ورق ترشيح رطب مُبطّن في أكواب سوفليه شفافة للغاية (حجم 1.25 أونصة سائلة، Dart Container Corp.، Mason، MI، الولايات المتحدة الأمريكية). وُضع ورق الترشيح الذي يحتوي على البيض في كيس مُحكم الإغلاق (SC Johnsons، Racine، WI) وحُفظ في درجة حرارة 26 درجة مئوية. فُقست البيوض، ورُبّي ما يقارب 200-250 يرقة في صوانٍ بلاستيكية تحتوي على خليط من علف الأرانب (ZuPreem، Premium Natural Products، Inc.، Mission، KS، الولايات المتحدة الأمريكية) ومسحوق الكبد (MP Biomedicals، LLC، Solon، OH، الولايات المتحدة الأمريكية). وشرائح السمك (TetraMin، Tetra GMPH، Meer، ألمانيا) بنسبة 2:1:1. تم استخدام يرقات الطور الثالث المتأخر في اختباراتنا البيولوجية.
تم الحصول على بذور النباتات المستخدمة في هذه الدراسة من المصادر التجارية والحكومية التالية: الخردل البني (Brassica juncea) (الخردل البني - باسيفيك جولد) والخردل الأبيض (Brassica juncea) (الخردل الأبيض - إيدا جولد) من جمعية مزارعي شمال غرب المحيط الهادئ التعاونية، ولاية واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية؛ والجرجير (نبات الرشاد) من شركة كيلي للبذور والأدوات، بيوريا، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية؛ ونبات ثلاسبي أرفينس (نبات الرشاد الحقلي - إليزابيث) من وزارة الزراعة الأمريكية - خدمة البحوث الزراعية، بيوريا، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية. لم تُعالج أي من البذور المستخدمة في الدراسة بالمبيدات. تمت معالجة جميع البذور واستخدامها في هذه الدراسة وفقًا للوائح المحلية والوطنية، وبالامتثال لجميع اللوائح المحلية والولائية والوطنية ذات الصلة. لم تتناول هذه الدراسة أصناف النباتات المعدلة وراثيًا.
طُحنت بذور الخردل الهندي (Brassica juncea) (PG)، والبرسيم الحجازي (Ls)، والخردل الأبيض (IG)، ونبات ذيل الحصان (Thlaspi arvense) (DFP) إلى مسحوق ناعم باستخدام مطحنة طرد مركزي فائقة السرعة من طراز Retsch ZM200 (شركة Retsch، هان، ألمانيا) مزودة بشبكة بفتحات 0.75 مم ودوار من الفولاذ المقاوم للصدأ ذي 12 سنًا، بسرعة 10000 دورة في الدقيقة (الجدول 1). نُقل مسحوق البذور المطحونة إلى أنبوب ورقي، ثم أُزيلت منه الدهون باستخدام الهكسان في جهاز سوكسلت لمدة 24 ساعة. عُولجت عينة فرعية من الخردل الحقلي منزوع الدهون حراريًا عند 100 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتعطيل إنزيم الميروسينيز ومنع تحلل الجلوكوزينولات لتكوين إيزوثيوسيانات نشطة بيولوجيًا. استُخدم مسحوق بذور ذيل الحصان المعالج حراريًا (DFP-HT) كعينة ضابطة سلبية لتعطيل إنزيم الميروسينيز.
تم تحديد محتوى الجلوكوزينولات في مسحوق البذور منزوع الدسم ثلاث مرات باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) وفقًا لبروتوكول منشور سابقًا (64). باختصار، أُضيف 3 مل من الميثانول إلى عينة وزنها 250 ملغ من مسحوق البذور منزوع الدسم. عُولجت كل عينة بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة، ثم تُركت في الظلام عند درجة حرارة 23 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، رُشِّح جزءٌ من الطبقة العضوية (1 مل) عبر مرشح 0.45 ميكرومتر إلى جهاز أخذ عينات تلقائي. باستخدام نظام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء من شركة شيمادزو (مضختان LC 20AD؛ جهاز أخذ عينات تلقائي SIL 20A؛ جهاز إزالة الغازات DGU 20As؛ كاشف SPD-20A للأشعة فوق البنفسجية والمرئية للمراقبة عند 237 نانومتر؛ ووحدة ناقل اتصال CBM-20A)، تم تحديد محتوى الجلوكوزينولات في مسحوق البذور ثلاث مرات. استُخدم برنامج Shimadzu LC Solution الإصدار 1.25 (شركة Shimadzu، كولومبيا، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية). كان العمود المستخدم عمود طور عكسي C18 Inertsil (250 مم × 4.6 مم؛ RP C-18، ODS-3، 5 ميكرومتر؛ GL Sciences، تورانس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). ضُبطت ظروف الطور المتحرك الأولية على 12% ميثانول/88% هيدروكسيد رباعي بوتيل الأمونيوم 0.01 مولار في الماء (TBAH؛ Sigma-Aldrich، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة. بعد حقن 15 ميكرولتر من العينة، حُفظت الظروف الأولية لمدة 20 دقيقة، ثم عُدّلت نسبة المذيب إلى 100% ميثانول، بإجمالي زمن تحليل للعينة 65 دقيقة. تم إنشاء منحنى معياري (باستخدام نانومول/مقياس الأجسام المضادة) عن طريق التخفيفات المتسلسلة لمعايير السينبين والجلوكوزينولات والميروسين المحضرة حديثًا (سيجما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقدير محتوى الكبريت في مسحوق البذور منزوع الدسم. تم اختبار تركيزات الجلوكوزينولات في العينات باستخدام جهاز كروماتوغرافيا سائلة عالي الأداء Agilent 1100 (أجيلنت، سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام برنامج OpenLAB CDS ChemStation الإصدار (C.01.07 SR2 [255]) المزود بنفس العمود وباستخدام طريقة موصوفة سابقًا. تم تحديد تركيزات الجلوكوزينولات لتكون قابلة للمقارنة بين أنظمة HPLC.
تم شراء أليل إيزوثيوسيانات (94%، مستقر) وبنزيل إيزوثيوسيانات (98%) من شركة فيشر ساينتيفيك (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). أما 4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات فقد تم شراؤه من شركة كيم كروز (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). عند تحللها إنزيميًا بواسطة إنزيم الميروسينيز، تُنتج الجلوكوزينولات أليل إيزوثيوسيانات، وبنزيل إيزوثيوسيانات، و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات، على التوالي.
أُجريت الاختبارات الحيوية المخبرية وفقًا لطريقة موتوري وآخرون32 مع بعض التعديلات. استُخدمت خمسة أنواع من أعلاف البذور قليلة الدسم في الدراسة: DFP، وDFP-HT، وIG، وPG، وLs. وُضعت عشرون يرقة في دورق ثلاثي الاستخدام سعة 400 مل (VWR International, LLC، رادنور، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية) يحتوي على 120 مل من الماء منزوع الأيونات (dH2O). تم اختبار سبعة تراكيز من مسحوق البذور لتحديد سميتها على يرقات البعوض: 0.01، 0.02، 0.04، 0.06، 0.08، 0.1، و0.12 غرام من مسحوق البذور/120 مل من الماء منزوع الأيونات لمسحوق بذور DFP، وDFP-HT، وIG، وPG على التوالي. تشير الاختبارات الحيوية الأولية إلى أن دقيق بذور Ls منزوع الدسم أكثر سمية من أنواع دقيق البذور الأربعة الأخرى التي تم اختبارها. لذلك، قمنا بتعديل تركيزات المعالجة السبعة لمسحوق بذور Ls إلى التركيزات التالية: 0.015، 0.025، 0.035، 0.045، 0.055، 0.065، و0.075 جم/120 مل من الماء المقطر.
أُدرجت مجموعة ضابطة غير معالجة (ماء مقطر، بدون إضافة مسحوق البذور) لتقييم معدل نفوق الحشرات الطبيعي في ظروف الاختبار. شملت الاختبارات البيولوجية السمية لكل مسحوق بذور ثلاث كؤوس مائلة ثلاثية التكرار (20 يرقة في الطور الثالث المتأخر لكل كأس)، بإجمالي 108 قوارير. حُفظت الحاويات المعالجة في درجة حرارة الغرفة (20-21 درجة مئوية)، وسُجل معدل نفوق اليرقات خلال 24 و72 ساعة من التعرض المستمر لتركيزات المعالجة. إذا لم يتحرك جسم البعوضة وأطرافها عند ثقبها أو لمسها بملعقة رقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ، تُعتبر يرقات البعوض ميتة. عادةً ما تبقى اليرقات الميتة بلا حراك في وضع ظهري أو بطني في قاع الحاوية أو على سطح الماء. كُررت التجربة ثلاث مرات في أيام مختلفة باستخدام مجموعات مختلفة من اليرقات، بإجمالي 180 يرقة تعرضت لكل تركيز من تركيزات المعالجة.
تم تقييم سمية مركبات AITC وBITC و4-HBITC ليرقات البعوض باستخدام نفس إجراء التحليل البيولوجي ولكن بمعالجات مختلفة. حضّر محاليل مركزة بتركيز 100,000 جزء في المليون لكل مادة كيميائية بإضافة 100 ميكرولتر من المادة الكيميائية إلى 900 ميكرولتر من الإيثانول المطلق في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل، ثم رجّ الأنبوب لمدة 30 ثانية حتى يمتزج جيدًا. حُدّدت تراكيز المعالجة بناءً على تحليلاتنا البيولوجية الأولية، والتي أظهرت أن BITC أكثر سمية بكثير من AITC و4-HBITC. لتحديد السمية، تم استخدام 5 تراكيز من BITC (1، 3، 6، 9، و12 جزءًا في المليون)، و7 تراكيز من AITC (5، 10، 15، 20، 25، 30، و35 جزءًا في المليون)، و6 تراكيز من 4-HBITC (15، 15، 20، 25، 30، و35 جزءًا في المليون، و30، 45، 60، 75، و90 جزءًا في المليون). تم حقن المجموعة الضابطة بـ 108 ميكرولتر من الإيثانول المطلق، وهو ما يعادل الحجم الأقصى للمعالجة الكيميائية. أُعيدت التجارب البيولوجية كما سبق، مع تعريض 180 يرقة لكل تركيز من تراكيز المعالجة. تم تسجيل معدل نفوق اليرقات لكل تركيز من AITC وBITC و4-HBITC بعد 24 ساعة من التعرض المستمر.
أُجري تحليل بروبيت لبيانات الوفيات المرتبطة بالجرعة لـ 65 يرقة باستخدام برنامج بولو (بولو بلس، ليورا سوفتوير، الإصدار 1.0) لحساب التركيز المميت بنسبة 50% (LC50)، والتركيز المميت بنسبة 90% (LC90)، والميل، ومعامل الجرعة المميتة، والتركيز المميت بنسبة 95%. واستندت هذه الحسابات إلى فترات الثقة لنسب الجرعات المميتة للتركيز المحوّل لوغاريتميًا ومنحنيات العلاقة بين الجرعة والوفيات. وتستند بيانات الوفيات إلى بيانات مُجمّعة من 180 يرقة تعرضت لكل تركيز من تركيزات المعالجة. وأُجريت تحليلات احتمالية بشكل منفصل لكل وجبة بذور ولكل مُكوّن كيميائي. وبناءً على فترة الثقة بنسبة 95% لنسبة الجرعة المميتة، اعتُبرت سمية وجبة البذور والمكونات الكيميائية ليرقات البعوض مختلفة بشكل ملحوظ، لذا فإن فترة الثقة التي تحتوي على القيمة 1 لا تُعتبر مختلفة بشكل ملحوظ، P = 0.0566.
تُدرج نتائج تحليل HPLC لتحديد الجلوكوزينولات الرئيسية في دقيق البذور منزوعة الدسم (DFP، IG، PG، وLs) في الجدول 1. تفاوتت الجلوكوزينولات الرئيسية في دقيق البذور المختبرة باستثناء DFP وPG، اللذين احتوى كلاهما على جلوكوزينولات الميروسينيز. كان محتوى الميروسينين في PG أعلى منه في DFP، حيث بلغ 33.3 ± 1.5 و26.5 ± 0.9 ملغم/غم على التوالي. احتوى مسحوق بذور Ls على 36.6 ± 1.2 ملغم/غم من الجلوكوجليكون، بينما احتوى مسحوق بذور IG على 38.0 ± 0.5 ملغم/غم من السينابين.
قُتلت يرقات بعوضة الزاعجة المصرية عند معالجتها بمسحوق بذور منزوع الدسم، مع اختلاف فعالية العلاج باختلاف أنواع النباتات. لم يكن مسحوق DFP-NT سامًا ليرقات البعوض بعد 24 و72 ساعة من التعرض (الجدول 2). ازدادت سمية مسحوق البذور النشط مع زيادة تركيزه (الشكل 1أ، ب). تباينت سمية مسحوق البذور ليرقات البعوض بشكل ملحوظ بناءً على فاصل الثقة 95% لنسبة الجرعة المميتة لقيم LC50 عند التقييم بعد 24 و72 ساعة (الجدول 3). بعد 24 ساعة، كان التأثير السام لمسحوق بذور Ls أكبر من معالجات مسحوق البذور الأخرى، حيث سجل أعلى فعالية وأقصى سمية لليرقات (LC50 = 0.04 جم/120 مل ماء مقطر). كانت اليرقات أقل حساسية لمركب DFP بعد 24 ساعة مقارنةً بمعاملات مسحوق بذور IG وLs وPG، حيث بلغت قيم LC50 0.115 و0.04 و0.08 غ/120 مل من الماء المقطر على التوالي، وهي أعلى إحصائيًا من قيمة LC50 البالغة 0.211 غ/120 مل من الماء المقطر (الجدول 3). أما قيم LC90 لمركب DFP وIG وPG وLs فكانت 0.376 و0.275 و0.137 و0.074 غ/120 مل من الماء المقطر على التوالي (الجدول 2). وكان أعلى تركيز لمركب DPP هو 0.12 غ/120 مل من الماء المقطر. بعد 24 ساعة من التقييم، بلغ متوسط معدل نفوق اليرقات 12% فقط، بينما وصل متوسط معدل نفوق يرقات IG وPG إلى 51% و82% على التوالي. بعد 24 ساعة من التقييم، بلغ متوسط معدل وفيات اليرقات لأعلى تركيز من معالجة وجبة بذور Ls (0.075 جم / 120 مل dH2O) 99٪ (الشكل 1A).
تم تقدير منحنيات الوفيات من خلال استجابة يرقات البعوضة المصرية (اليرقات في الطور الثالث) للجرعة (بروبيت) لتركيز مسحوق البذور بعد 24 ساعة (أ) و72 ساعة (ب) من المعالجة. يمثل الخط المنقط تركيز LC50 لمعالجة مسحوق البذور. DFP: نبات ثلاسبي أرفينس، DFP-HT: نبات ثلاسبي أرفينس المعطل حرارياً، IG: نبات الخردل الأبيض (إيدا جولد)، PG: نبات الخردل الهندي (باسيفيك جولد)، Ls: نبات الرشاد (ليبيديوم ساتيفوم).
في التقييم الذي أُجري بعد 72 ساعة، بلغت قيم LC50 لمسحوق بذور DFP وIG وPG على التوالي 0.111 و0.085 و0.051 غ/120 مل من الماء المقطر. نفقت جميع اليرقات تقريبًا المعرضة لمسحوق بذور Ls بعد 72 ساعة من التعرض، لذا لم تتوافق بيانات الوفيات مع تحليل بروبيت. بالمقارنة مع أنواع مسحوق البذور الأخرى، كانت اليرقات أقل حساسية لمعالجة مسحوق بذور DFP، وسجلت قيم LC50 أعلى إحصائيًا (الجدولان 2 و3). بعد 72 ساعة، قُدِّرت قيم LC50 لمعالجات مسحوق بذور DFP وIG وPG على التوالي بـ 0.111 و0.085 و0.05 غ/120 مل من الماء المقطر. بعد 72 ساعة من التقييم، بلغت قيم LC90 لمساحيق بذور DFP وIG وPG على التوالي 0.215 و0.254 و0.138 غ/120 مل من الماء المقطر. وبعد 72 ساعة من التقييم، بلغ متوسط معدل نفوق اليرقات في معالجات مسحوق بذور DFP وIG وPG عند تركيز أقصى قدره 0.12 غ/120 مل من الماء المقطر 58% و66% و96% على التوالي (الشكل 1ب). وبعد 72 ساعة من التقييم، تبين أن مسحوق بذور PG أكثر سمية من مسحوقي بذور IG وDFP.
تُعدّ مركبات الإيزوثيوسيانات الاصطناعية، مثل أليل إيزوثيوسيانات (AITC) وبنزيل إيزوثيوسيانات (BITC) و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات (4-HBITC)، فعّالة في قتل يرقات البعوض. بعد 24 ساعة من المعالجة، كان BITC أكثر سميةً لليرقات، حيث بلغت قيمة LC50 له 5.29 جزء في المليون، مقارنةً بـ 19.35 جزء في المليون لـ AITC و55.41 جزء في المليون لـ 4-HBITC (الجدول 4). وبالمقارنة مع AITC وBITC، يتميز 4-HBITC بسمية أقل وقيمة LC50 أعلى. وتوجد اختلافات ملحوظة في سمية يرقات البعوض بين مركبي الإيزوثيوسيانات الرئيسيين (Ls وPG) في مسحوق البذور الأكثر فعالية. أظهرت السمية، بناءً على نسبة الجرعة المميتة لقيم LC50 بين مركبات AITC وBITC و4-HBITC، فرقًا إحصائيًا ذا دلالة، حيث لم تتضمن فترة الثقة 95% لنسبة الجرعة المميتة LC50 القيمة 1 (P = 0.05، الجدول 4). وقد قُدِّر أن أعلى تركيزات كل من BITC وAITC كافية لقتل 100% من اليرقات المختبرة (الشكل 2).
تم تقدير منحنيات الوفيات من خلال استجابة الجرعة (بروبيت) ليرقات البعوض المصري (اليرقات في الطور الثالث) بعد 24 ساعة من المعالجة، حيث وصلت إلى تركيزات إيزوثيوسيانات اصطناعية. يمثل الخط المنقط تركيز LC50 للمعالجة بالإيزوثيوسيانات. إيزوثيوسيانات البنزيل (BITC)، وإيزوثيوسيانات الأليل (AITC)، و4-هيدروكسي إيزوثيوسيانات البنزيل (4-HBITC).
لطالما دُرست استخدامات المبيدات الحيوية النباتية كعوامل لمكافحة نواقل البعوض. تنتج العديد من النباتات مواد كيميائية طبيعية ذات فعالية مبيدة للحشرات.37 توفر مركباتها النشطة بيولوجيًا بديلاً جذابًا للمبيدات الحشرية الاصطناعية، لما لها من إمكانات كبيرة في مكافحة الآفات، بما في ذلك البعوض.
تُزرع نباتات الخردل كمحصول لبذورها، التي تُستخدم كتوابل ومصدر للزيت. عند استخلاص زيت الخردل من البذور، أو عند استخلاص الخردل لاستخدامه كوقود حيوي، ينتج عن ذلك مسحوق بذور منزوع الدسم. يحتفظ هذا المسحوق بالعديد من مكوناته الكيميائية الحيوية الطبيعية وإنزيماته المحللة. تُعزى سمية هذا المسحوق إلى إنتاج الإيزوثيوسيانات. تتكون الإيزوثيوسيانات من خلال تحلل الجلوكوزينولات بواسطة إنزيم الميروسينيز أثناء ترطيب مسحوق البذور، ومن المعروف أن لها تأثيرات مبيدة للفطريات والبكتيريا والديدان الخيطية والحشرات، بالإضافة إلى خصائص أخرى تشمل التأثيرات الحسية الكيميائية والخصائص العلاجية الكيميائية. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن نباتات الخردل ومسحوق بذورها تعمل بفعالية كمبيدات تبخير ضد آفات التربة والأغذية المخزنة. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم سمية مسحوق بذور الكرنب ومشتقاته النشطة بيولوجيًا الثلاثة، وهي AITC وBITC و4-HBITC، على يرقات بعوضة الزاعجة المصرية (Aedes aegypti). من المتوقع أن تؤدي إضافة مسحوق البذور مباشرةً إلى الماء المحتوي على يرقات البعوض إلى تنشيط العمليات الإنزيمية التي تُنتج مركبات إيزوثيوسيانات سامة ليرقات البعوض. وقد تم إثبات هذا التحول الحيوي جزئيًا من خلال النشاط المبيد لليرقات الذي لوحظ في مسحوق البذور، وفقدان هذا النشاط عند معالجة مسحوق بذور الخردل القزم حراريًا قبل الاستخدام. من المتوقع أن تُدمر المعالجة الحرارية الإنزيمات المحللة التي تُنشط الجلوكوزينولات، وبالتالي تمنع تكوين مركبات الإيزوثيوسيانات النشطة بيولوجيًا. تُعد هذه الدراسة الأولى التي تؤكد الخصائص المبيدة للحشرات لمسحوق بذور الكرنب ضد البعوض في البيئة المائية.
من بين مساحيق البذور المختبرة، كان مسحوق بذور الجرجير (Ls) الأكثر سمية، حيث تسبب في معدل وفيات مرتفع ليرقات بعوضة الزاعجة المرقطة (Aedes albopictus). تمت معالجة يرقات بعوضة الزاعجة المصرية (Aedes aegypti) بشكل مستمر لمدة 24 ساعة. أظهرت مساحيق البذور الثلاثة المتبقية (PG وIG وDFP) فعالية أبطأ، ومع ذلك تسببت في معدل وفيات مرتفع حتى بعد 72 ساعة من المعالجة المستمرة. احتوى مسحوق بذور الجرجير (Ls) فقط على كميات كبيرة من الجلوكوزينولات، بينما احتوى كل من مسحوقي PG وDFP على إنزيم الميروسينيز، واحتوى مسحوق IG على الجلوكوزينولات كمركب رئيسي (الجدول 1). يتحلل الجلوكوتروبايولين إلى BITC، ويتحلل السينالبين إلى 4-HBITC61,62. تشير نتائج اختباراتنا البيولوجية إلى أن كلاً من مسحوق بذور الجرجير (Ls) وBITC الاصطناعي شديد السمية ليرقات البعوض. المكون الرئيسي لمسحوقي بذور الجرجير (PG) وDFP هو جلوكوزينولات الميروسينيز، والذي يتحلل إلى AITC. يُعدّ مركب AITC فعالاً في قتل يرقات البعوض بقيمة LC50 تبلغ 19.35 جزءًا في المليون. وبالمقارنة مع مركبي AITC وBITC، يُعتبر مركب 4-HBITC إيزوثيوسيانات الأقل سميةً لليرقات. وعلى الرغم من أن مركب AITC أقل سميةً من مركب BITC، إلا أن قيم LC50 الخاصة بهما أقل من قيم العديد من الزيوت العطرية التي تم اختبارها على يرقات البعوض.
يحتوي مسحوق بذور الخضراوات الصليبية المُستخدم لمكافحة يرقات البعوض على غلوكوزينولات رئيسي واحد، يُشكّل ما يزيد عن 98-99% من إجمالي الغلوكوزينولات وفقًا لتحليل HPLC. تم الكشف عن كميات ضئيلة من غلوكوزينولات أخرى، لكن مستوياتها كانت أقل من 0.3% من إجمالي الغلوكوزينولات. يحتوي مسحوق بذور الجرجير (L. sativum) على غلوكوزينولات ثانوية (سينغرين)، لكن نسبتها 1% فقط من إجمالي الغلوكوزينولات، ومحتواها ضئيل جدًا (حوالي 0.4 ملغم/غرام من مسحوق البذور). على الرغم من احتواء كل من مسحوق بذور PG وDFP على نفس الغلوكوزينولات الرئيسي (ميروسين)، إلا أن فعالية مبيدات اليرقات في مسحوقي بذورهما تختلف اختلافًا كبيرًا نظرًا لاختلاف قيم LC50. كما يختلفان في سميتهما لمرض البياض الدقيقي. قد يعود ظهور يرقات بعوضة الزاعجة المصرية إلى اختلافات في نشاط أو استقرار إنزيم الميروسينيز بين نوعي البذور المُغذّاة. يلعب نشاط الميروسينيز دورًا هامًا في التوافر الحيوي لمنتجات التحلل المائي، مثل الإيزوثيوسيانات، في نباتات الفصيلة الصليبية.76 وقد أظهرت دراسات سابقة أجراها كل من بوكوك وآخرون77 وويلكنسون وآخرون78 أن التغيرات في نشاط واستقرار الميروسينيز قد ترتبط أيضًا بعوامل وراثية وبيئية.
تم حساب محتوى الإيزوثيوسيانات النشط بيولوجيًا المتوقع بناءً على قيم LC50 لكل نوع من أنواع مسحوق البذور بعد 24 و72 ساعة (الجدول 5) للمقارنة مع التطبيقات الكيميائية المقابلة. بعد 24 ساعة، كانت الإيزوثيوسيانات الموجودة في مسحوق البذور أكثر سمية من المركبات النقية. وكانت قيم LC50 المحسوبة بناءً على أجزاء في المليون (ppm) من معالجات بذور الإيزوثيوسيانات أقل من قيم LC50 لتطبيقات BITC وAITC و4-HBITC. لوحظ استهلاك اليرقات لحبيبات مسحوق البذور (الشكل 3أ). وبالتالي، قد تتعرض اليرقات لتركيز أعلى من الإيزوثيوسيانات السامة عن طريق تناول حبيبات مسحوق البذور. كان هذا واضحًا بشكل خاص في معالجات مسحوق البذور IG وPG بعد 24 ساعة من التعرض، حيث كانت تركيزات LC50 أقل بنسبة 75% و72% على التوالي من معالجات AITC و4-HBITC النقية. كانت معالجات Ls وDFP أكثر سمية من الإيزوثيوسيانات النقي، حيث كانت قيم LC50 أقل بنسبة 24% و41% على التوالي. نجحت يرقات المجموعة الضابطة في التعذر (الشكل 3ب)، بينما لم تتعذر معظم يرقات المجموعة المعالجة بمسحوق البذور، وتأخر نمو اليرقات بشكل ملحوظ (الشكل 3ب، د). في حشرة Spodoptera teralitura، ترتبط الإيزوثيوسيانات بتأخر النمو والتطور79.
تعرضت يرقات بعوضة الزاعجة المصرية (Ae. aedes aegypti) باستمرار لمسحوق بذور الكرنب لمدة تتراوح بين 24 و72 ساعة. (أ) يرقات ميتة مع جزيئات من مسحوق البذور في أجزاء الفم (مُحاطة بدائرة)؛ (ب) تُظهر المعالجة الضابطة (ماء مقطر بدون إضافة مسحوق البذور) أن اليرقات تنمو بشكل طبيعي وتبدأ في التعذر بعد 72 ساعة. (ج، د) يرقات مُعالجة بمسحوق البذور؛ أظهر مسحوق البذور اختلافات في النمو ولم تتعذر.
لم ندرس آلية التأثيرات السامة للإيزوثيوسيانات على يرقات البعوض. مع ذلك، أظهرت دراسات سابقة على النمل الناري الأحمر (Solenopsis invicta) أن تثبيط إنزيم ناقل الغلوتاثيون إس (GST) وإنزيم الإستراز (EST) هو الآلية الرئيسية للنشاط الحيوي للإيزوثيوسيانات، وأن مركب AITC، حتى بتركيزات منخفضة، قادر على تثبيط نشاط إنزيم GST. وقد تم اختبار تركيز منخفض من AITC على النمل الناري الأحمر المستورد، حيث بلغت الجرعة 0.5 ميكروغرام/مل. في المقابل، يثبط AITC إنزيم أستيل كولين إستراز في سوسة الذرة البالغة (Sitophilus zeamais). لذا، يجب إجراء دراسات مماثلة لتوضيح آلية عمل الإيزوثيوسيانات في يرقات البعوض.
استخدمنا معالجة DFP المُعطَّلة حراريًا لدعم فرضية أن تحلل الجلوكوزينولات النباتية لتكوين إيزوثيوسيانات تفاعلية يُعد آليةً لمكافحة يرقات البعوض بواسطة مسحوق بذور الخردل. لم يكن مسحوق بذور DFP-HT سامًا عند معدلات الاستخدام المختبرة. أفاد لافارجا وآخرون82 أن الجلوكوزينولات حساسة للتحلل عند درجات الحرارة العالية. من المتوقع أيضًا أن تُؤدي المعالجة الحرارية إلى تعطيل إنزيم الميروسينيز في مسحوق البذور ومنع تحلل الجلوكوزينولات لتكوين إيزوثيوسيانات تفاعلية. وقد أكد أوكونادي وآخرون75 ذلك، حيث أظهروا أن الميروسينيز حساس لدرجة الحرارة، إذ تم تعطيل نشاطه تمامًا عند تعريض بذور الخردل، والخردل الأسود، وبذور نبات الدم لدرجات حرارة أعلى من 80 درجة مئوية. قد تُؤدي هذه الآليات إلى فقدان فعالية مسحوق بذور DFP المُعالج حراريًا كمبيد حشري.
وبالتالي، فإن مسحوق بذور الخردل ومكوناته الثلاثة الرئيسية من الإيزوثيوسيانات سامة ليرقات البعوض. ونظرًا لهذه الاختلافات بين مسحوق البذور والمعالجات الكيميائية، قد يكون استخدام مسحوق البذور طريقة فعالة لمكافحة البعوض. ثمة حاجة لتحديد تركيبات مناسبة وأنظمة توصيل فعالة لتحسين فعالية واستقرار استخدام مساحيق البذور. تشير نتائجنا إلى إمكانية استخدام مسحوق بذور الخردل كبديل للمبيدات الحشرية الاصطناعية. قد تصبح هذه التقنية أداة مبتكرة لمكافحة نواقل البعوض. ولأن يرقات البعوض تزدهر في البيئات المائية، ولأن غلوكوزينولات مسحوق البذور تتحول إنزيميًا إلى إيزوثيوسيانات نشطة عند ترطيبها، فإن استخدام مسحوق بذور الخردل في المياه الموبوءة بالبعوض يوفر إمكانات كبيرة للمكافحة. على الرغم من أن فعالية الإيزوثيوسيانات المبيدة لليرقات تختلف (BITC > AITC > 4-HBITC)، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد ما إذا كان الجمع بين مسحوق البذور والعديد من الغلوكوزينولات يزيد من السمية بشكل تآزري. هذه هي الدراسة الأولى التي تُثبت فعالية مسحوق بذور الخضراوات الصليبية منزوعة الدسم وثلاثة مركبات إيزوثيوسيانات حيوية في مكافحة البعوض. وتُعدّ نتائج هذه الدراسة رائدةً في هذا المجال، إذ تُظهر أن مسحوق بذور الملفوف منزوع الدسم، وهو منتج ثانوي لاستخلاص الزيت من البذور، قد يُستخدم كعامل واعد لمكافحة يرقات البعوض. ويمكن لهذه المعلومات أن تُسهم في تعزيز اكتشاف عوامل المكافحة الحيوية النباتية وتطويرها كمبيدات حيوية رخيصة وعملية وصديقة للبيئة.
تتوفر مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها لهذه الدراسة والتحليلات الناتجة عنها من المؤلف المسؤول عند الطلب. وفي نهاية الدراسة، تم إتلاف جميع المواد المستخدمة فيها (الحشرات ومسحوق البذور).
تاريخ النشر: 29 يوليو 2024