النشاط البيولوجي لمسحوق بذور الكرنب ومركباته كمبيد يرقات صديق للبيئة ضد البعوض

لفعاليةمكافحة البعوضوللحد من انتشار الأمراض التي تحملها، هناك حاجة إلى بدائل استراتيجية ومستدامة وصديقة للبيئة للمبيدات الكيميائية. قمنا بتقييم بذور بعض فصائل الكرنب (فصيلة البراسيكا) كمصدر للإيزوثيوسيانات المشتقة من النباتات، والمُنتجة عن طريق التحليل المائي الأنزيمي للجلوكوزينولات غير النشطة بيولوجيًا، لاستخدامها في مكافحة بعوضة الزاعجة المصرية (L., 1762). دقيق بذور منزوع الدسم (Brassica juncea (L) Czern.، 1859، Lepidium sativum L.، 1753، Sinapis alba L.، 1753، Thlaspi arvense L.، 1753 وThlaspi arvense - ثلاثة أنواع رئيسية من التثبيط الحراري والتحلل الإنزيمي. المنتجات الكيميائية لتحديد سمية (LC50) إيزوثيوسيانات الأليل، إيزوثيوسيانات البنزيل، و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات ليرقات الزاعجة المصرية عند التعرض لمدة 24 ساعة = 0.04 جم/120 مل dH2O). قيم LC50 للخردل، والخردل الأبيض، وذيل الحصان. بلغت نسبة سمية وجبة البذور 0.05 و0.08 و0.05 على التوالي، مقارنةً بإيزوثيوسيانات الأليل (LC50 = 19.35 جزء في المليون)، وكان 4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات (LC50 = 55.41 جزء في المليون) أكثر سمية لليرقات بعد 24 ساعة من المعالجة مقارنةً بـ 0.1 غ/120 مل من dH2O على التوالي. تتوافق هذه النتائج مع إنتاج وجبة بذور البرسيم. تتوافق الكفاءة العالية لإسترات البنزيل مع قيم LC50 المحسوبة. يمكن أن يوفر استخدام وجبة البذور طريقة فعالة لمكافحة البعوض. تُظهر فعالية مسحوق بذور الفصيلة الصليبية ومكوناته الكيميائية الرئيسية ضد يرقات البعوض كيف يمكن للمركبات الطبيعية في مسحوق بذور الفصيلة الصليبية أن تكون بمثابة مبيد يرقات صديق للبيئة واعد لمكافحة البعوض.
لا تزال الأمراض المنقولة بالنواقل، والتي تسببها بعوضة الزاعجة (Aedes)، تُمثل مشكلة صحية عامة عالمية رئيسية. ينتشر انتشار الأمراض المنقولة بالبعوض جغرافيًا1،2،3، ويعاود الظهور، مما يؤدي إلى تفشي أمراض خطيرة4،5،6،7. يُعد انتشار الأمراض بين البشر والحيوانات (مثل حمى شيكونغونيا، وحمى الضنك، وحمى الوادي المتصدع، والحمى الصفراء، وفيروس زيكا) غير مسبوق. تُعرّض حمى الضنك وحدها ما يقرب من 3.6 مليار شخص لخطر الإصابة في المناطق الاستوائية، مع حدوث ما يُقدر بـ 390 مليون إصابة سنويًا، مما يؤدي إلى وفاة ما بين 6,100 و24,300 شخص سنويًا8. وقد جذب ظهور فيروس زيكا وتفشيه في أمريكا الجنوبية اهتمامًا عالميًا نظرًا لتلف الدماغ الذي يُسببه لدى الأطفال المولودين لنساء مصابات2. ويتوقع كريمر وآخرون3 أن يستمر اتساع النطاق الجغرافي لبعوضة الزاعجة، وأنه بحلول عام 2050، سيكون نصف سكان العالم معرضين لخطر الإصابة بفيروسات المفصليات التي ينقلها البعوض.
باستثناء اللقاحات المُطوّرة حديثًا ضد حمى الضنك والحمى الصفراء، لم تُطوّر بعد لقاحاتٌ ضد معظم الأمراض التي ينقلها البعوض. ولا تزال اللقاحات متوفرة بكميات محدودة، وتُستخدم فقط في التجارب السريرية. وتُعدّ مكافحة نواقل البعوض باستخدام المبيدات الحشرية الاصطناعية استراتيجيةً أساسيةً للحد من انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض. ورغم فعالية المبيدات الاصطناعية في قتل البعوض، إلا أن استمرار استخدامها يؤثر سلبًا على الكائنات غير المستهدفة ويُلوّث البيئة. والأمر الأكثر إثارةً للقلق هو اتجاه تزايد مقاومة البعوض للمبيدات الكيميائية. وقد سرّعت هذه المشاكل المرتبطة بالمبيدات من البحث عن بدائل فعّالة وصديقة للبيئة لمكافحة نواقل الأمراض.
طُوِّرت نباتاتٌ مُختلفةٌ كمصادرٍ للمبيدات النباتية لمكافحة الآفات20،21. تُعتبر المواد النباتية صديقةً للبيئة بشكلٍ عام، نظرًا لقابليتها للتحلل الحيوي، وسميتها المنخفضة أو المُهملة للكائنات غير المُستهدفة، مثل الثدييات والأسماك والبرمائيات20،22. ومن المعروف أن المُستحضرات العشبية تُنتج مجموعةً مُتنوعةً من المُركّبات النشطة بيولوجيًا ذات آليات عمل مُختلفة، تُساعد على مكافحة البعوض بفعالية في مراحله العمرية المُختلفة23،24،25،26. وقد حظيت المُركّبات المُشتقة من النباتات، مثل الزيوت العطرية ومُكوّنات النباتات النشطة الأخرى، باهتمامٍ كبير، ومهدت الطريق لأدواتٍ مُبتكرةٍ لمكافحة نواقل البعوض. تعمل الزيوت العطرية، والتربينات الأحادية، والتربينات السيسكيتربينية كطارداتٍ للحشرات، ومضاداتٍ للتغذية، ومُبيداتٍ للبيض27،28،29،30،31،32،33. تُسبّب العديد من الزيوت النباتية موت يرقات البعوض، والشرانق، والحشرات البالغة34،35،36، مُؤثّرةً على الجهاز العصبي، والجهاز التنفسي، والغدد الصماء، وغيرها من الأجهزة المهمة للحشرات37.
قدمت دراسات حديثة نظرة ثاقبة حول الاستخدام المحتمل لنباتات الخردل وبذورها كمصدر للمركبات النشطة بيولوجيًا. اختُبر مسحوق بذور الخردل كمبيد حيوي 38،39،40،41، واستُخدم كمُحسِّن للتربة لقمع الأعشاب الضارة 42،43،44، ومكافحة مسببات الأمراض النباتية التي تنتقل عبر التربة 45،46،47،48،49،50، وتغذية النبات. النيماتودا 41،51،52،53،54، والآفات 55،56،57،58،59،60. يُعزى النشاط المُبيد للفطريات لمساحيق البذور هذه إلى مركبات واقية للنبات تُسمى إيزوثيوسيانات 38،42،60. في النباتات، تُخزَّن هذه المركبات الواقية في خلايا النبات على شكل جلوكوسينولات غير نشطة بيولوجيًا. ومع ذلك، عندما تتضرر النباتات نتيجة تغذية الحشرات أو الإصابة بمسببات الأمراض، تُحلل الجلوكوسينولات بواسطة الميروزيناز إلى إيزوثيوسيانات نشطة حيويًا55،61. الإيزوثيوسيانات مركبات متطايرة معروفة بنشاطها المضاد للميكروبات والحشرات واسع النطاق، ويختلف تركيبها ونشاطها البيولوجي ومحتواها اختلافًا كبيرًا بين أنواع الفصيلة الصليبية42،59،62،63.
على الرغم من أن الإيزوثيوسيانات المشتقة من دقيق بذور الخردل معروفة بنشاطها المبيد للحشرات، إلا أن البيانات المتعلقة بالنشاط البيولوجي ضد نواقل المفصليات المهمة طبيًا غير متوفرة. درست دراستنا النشاط المبيد لليرقات لأربعة مساحيق بذور منزوعة الدهن ضد بعوض الزاعجة المصرية (Aedes aegypti). كان الهدف من الدراسة تقييم إمكانية استخدامها كمبيدات حيوية صديقة للبيئة لمكافحة البعوض. كما تم اختبار ثلاثة مكونات كيميائية رئيسية من دقيق البذور، وهي إيزوثيوسيانات الأليل (AITC)، وإيزوثيوسيانات البنزيل (BITC)، و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات (4-HBITC)، لاختبار النشاط البيولوجي لهذه المكونات الكيميائية على يرقات البعوض. يُعد هذا أول تقرير يُقيّم فعالية أربعة مساحيق من بذور الكرنب ومكوناتها الكيميائية الرئيسية ضد يرقات البعوض.
حُفظت مستعمرات بعوض الزاعجة المصرية (سلالة روكفلر) المخبرية عند درجة حرارة 26 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 70%، وفترة ضوئية 10:14 ساعة (الفترة الضوئية L:D). وُضعت الإناث المُخصَّصة في أقفاص بلاستيكية (ارتفاعها 11 سم وقطرها 9.5 سم)، وتلقَّت التغذية عبر نظام تغذية بالزجاجة باستخدام دم البقر المُسْتَرات (شركة هيموستات لابوراتوريز، ديكسون، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). أُجريت التغذية بالدم كالمعتاد باستخدام مُغذِّي غشائي متعدد الزجاجات (شركة كيم جلاس، شركة علوم الحياة، فينلاند، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) مُتصل بأنبوب حمام مائي دائري (هايك إس 7، شركة ثيرمو-ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. مدد غشاءً من بارافيلم إم على قاع كل حجرة تغذية زجاجية (مساحة 154 مم²). ثم وُضع كل مُغذِّي على الشبكة العلوية التي تُغطي القفص الذي يحتوي على أنثى التزاوج. أُضيف ما يقارب 350-400 ميكرولتر من دم البقر إلى قمع تغذية زجاجي باستخدام ماصة باستور (فيشر براند، فيشر ساينتيفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية)، وسُمح للديدان البالغة بالتصريف لمدة ساعة على الأقل. ثم أُعطيت الإناث الحوامل محلول سكروز بنسبة 10%، وسُمح لها بوضع البيض على ورق ترشيح رطب مُبطّن بأكواب سوفليه فردية فائقة النقاء (بحجم 1.25 أونصة سائلة، شركة دارت كونتينر، ماسون، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية). وُضع ورق الترشيح الذي يحتوي على البيض في كيس مُحكم الغلق (شركة إس سي جونسونز، راسين، ويسكونسن) وحُفظ في درجة حرارة 26 درجة مئوية. فُقست البيضات، ورُبيت ما يقارب 200-250 يرقة في صواني بلاستيكية تحتوي على خليط من علف الأرانب (زوبريم، بريميوم ناتشورال برودكتس، إنك، ميشن، كانساس، الولايات المتحدة الأمريكية) ومسحوق كبد (إم بي بيوميديكالز، إل إل سي، سولون، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية). وشرائح السمك (TetraMin، Tetra GMPH، Meer، ألمانيا) بنسبة ٢:١:١. استُخدمت يرقات الطور الثالث المتأخر في اختباراتنا الحيوية.
تم الحصول على بذور النباتات المستخدمة في هذه الدراسة من المصادر التجارية والحكومية التالية: براسيكا جونسيا (خردل بني - باسيفيك جولد) وبراسيكا جونسيا (خردل أبيض - إيدا جولد) من تعاونية مزارعي شمال غرب المحيط الهادئ، ولاية واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية؛ وجرجير الحدائق (جرجير الحدائق) من شركة كيلي للبذور والأدوات، بيوريا، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية؛ وجرجير ثلاسبي أرفنس (قرنفل الحقل - إليزابيث) من وزارة الزراعة الأمريكية - دائرة البحوث الزراعية، بيوريا، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية؛ ولم تُعالَج أيٌّ من البذور المستخدمة في الدراسة بالمبيدات الحشرية. عُولجت جميع مواد البذور واستُخدمت في هذه الدراسة وفقًا للوائح المحلية والوطنية، وبما يتوافق مع جميع اللوائح المحلية والوطنية ذات الصلة. لم تُجرَ هذه الدراسة على أصناف النباتات المُعدّلة وراثيًا.
طُحِنت بذور براسيكا جونسيا (PG)، والبرسيم الحجازي (Ls)، والخردل الأبيض (IG)، وثلاسبي أرفنس (DFP) إلى مسحوق ناعم باستخدام مطحنة Retsch ZM200 فائقة الطرد المركزي (Retsch، هان، ألمانيا)، مزودة بشبكة قطرها 0.75 مم، ودوار من الفولاذ المقاوم للصدأ، و12 سنًا، وسرعة دوران 10,000 دورة في الدقيقة (الجدول 1). نُقل مسحوق البذور المطحونة إلى كشتبان ورقي، وفُكّ الدهن باستخدام الهكسان في جهاز سوكسليت لمدة 24 ساعة. عولجت عينة فرعية من خردل الحقل منزوع الدهن حراريًا عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتفكيك الميروزيناز ومنع تحلل الجلوكوزينولات لتكوين إيزوثيوسيانات نشطة بيولوجيًا. استُخدم مسحوق بذور ذيل الحصان المعالج حراريًا (DFP-HT) كشاهد سلبي عن طريق تفكيك الميروزيناز.
تم تحديد محتوى الجلوكوزينولات في وجبة البذور منزوعة الدهن في ثلاث نسخ باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC) وفقًا لبروتوكول منشور مسبقًا 64. باختصار، تمت إضافة 3 مل من الميثانول إلى عينة 250 مجم من مسحوق البذور منزوعة الدهن. تم معالجة كل عينة بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة وتركها في الظلام عند درجة حرارة 23 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. ثم تم ترشيح جزء 1 مل من الطبقة العضوية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر في جهاز أخذ العينات التلقائي. يعمل على نظام Shimadzu HPLC (مضختان LC 20AD؛ جهاز أخذ العينات التلقائي SIL 20A؛ مزيل الغاز DGU 20As؛ كاشف SPD-20A UV-VIS للمراقبة عند 237 نانومتر؛ ووحدة ناقل الاتصالات CBM-20A)، تم تحديد محتوى الجلوكوزينولات في وجبة البذور في ثلاث نسخ. باستخدام برنامج Shimadzu LC Solution الإصدار 1.25 (شركة Shimadzu، كولومبيا، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية). كان العمود عبارة عن عمود طور عكسي من مادة Inertsil C18 (250 مم × 4.6 مم؛ RP C-18، ODS-3، 5u؛ GL Sciences، تورانس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). حُدِّدت ظروف الطور المتحرك الأولية عند 12% ميثانول/88% 0.01 مولار من هيدروكسيد رباعي بوتيل الأمونيوم في الماء (TBAH؛ Sigma-Aldrich، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة. بعد حقن 15 ميكرولتر من العينة، حُفِظَت الظروف الأولية لمدة 20 دقيقة، ثم عُدِّلَت نسبة المذيب إلى 100% ميثانول، ليبلغ إجمالي وقت تحليل العينة 65 دقيقة. تم إنشاء منحنى قياسي (يعتمد على نانومول/مللي أجسام مضادة) من خلال التخفيفات المتسلسلة لمعايير سينابين، وجلوكوسينولات، وميروسين المُحضرة حديثًا (سيجما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقدير محتوى الكبريت في دقيق البذور منزوع الدهن. اختُبرت تركيزات الجلوكوسينولات في العينات باستخدام جهاز Agilent 1100 HPLC (أجيلنت، سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام إصدار OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) المجهز بنفس العمود وباستخدام الطريقة الموصوفة سابقًا. حُددت تركيزات الجلوكوسينولات؛ ويمكن مقارنتها بين أنظمة HPLC.
تم شراء إيزوثيوسيانات الأليل (94%، ثابت) وإيزوثيوسيانات البنزيل (98%) من شركة فيشر ساينتفك (ثيرمو فيشر ساينتفك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). أما 4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات، فقد تم شراؤه من شركة كيم كروز (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). عند التحليل الإنزيمي بواسطة الميروزيناز، تُشكل الجلوكوسينولات، والجلوكوسينولات، والجلوكوسينولات إيزوثيوسيانات الأليل، وإيزوثيوسيانات البنزيل، و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات، على التوالي.
أُجريت الاختبارات الحيوية المخبرية وفقًا لطريقة موتوري وآخرون 32 مع بعض التعديلات. استُخدمت خمسة أنواع من أعلاف البذور قليلة الدسم في الدراسة: DFP، وDFP-HT، وIG، وPG، وLs. وُضعت عشرون يرقة في دورق ثلاثي الاتجاهات للاستخدام مرة واحدة سعة 400 مل (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) يحتوي على 120 مل من الماء منزوع الأيونات (dH2O). اختُبرت سبعة تركيزات من دقيق البذور لسمية يرقات البعوض: 0.01، 0.02، 0.04، 0.06، 0.08، 0.1 و0.12 جم من دقيق البذور/120 مل من dH2O لدقيق بذور DFP، وDFP-HT، وIG، وPG. تشير الاختبارات الحيوية الأولية إلى أن دقيق بذور Ls منزوع الدهن أكثر سمية من أربعة أنواع أخرى من دقيق البذور التي تم اختبارها. لذلك، قمنا بتعديل تركيزات المعالجة السبعة لوجبة بذور Ls إلى التركيزات التالية: 0.015، 0.025، 0.035، 0.045، 0.055، 0.065، و 0.075 جم / 120 مل dH2O.
تم تضمين مجموعة ضابطة غير معالجة (dH20، بدون مكمل وجبة البذور) لتقييم معدل وفيات الحشرات الطبيعي في ظل ظروف الاختبار. تضمنت الاختبارات البيولوجية السمية لكل وجبة بذور ثلاثة أكواب مكررة ثلاثية المنحدر (20 يرقة متأخرة من الطور الثالث لكل كوب)، بإجمالي 108 قوارير. تم تخزين الحاويات المعالجة في درجة حرارة الغرفة (20-21 درجة مئوية) وتم تسجيل وفيات اليرقات خلال 24 و 72 ساعة من التعرض المستمر لتركيزات العلاج. إذا لم يتحرك جسم البعوض وملحقاته عند ثقبه أو لمسه بملعقة رفيعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، فإن يرقات البعوض تعتبر ميتة. عادة ما تبقى اليرقات الميتة بلا حراك في وضع ظهري أو بطني في قاع الحاوية أو على سطح الماء. تم تكرار التجربة ثلاث مرات في أيام مختلفة باستخدام مجموعات مختلفة من اليرقات، بإجمالي 180 يرقة معرضة لكل تركيز علاجي.
تم تقييم سمية AITC وBITC و4-HBITC ليرقات البعوض باستخدام نفس إجراء الاختبار الحيوي ولكن بمعالجات مختلفة. حضّر محلولًا مخزنًا بتركيز 100,000 جزء في المليون لكل مادة كيميائية عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المادة الكيميائية إلى 900 ميكرولتر من الإيثانول المطلق في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل، ثم رجّ الأنبوب لمدة 30 ثانية لخلطه جيدًا. حُددت تركيزات المعالجة بناءً على اختباراتنا الحيوية الأولية، والتي أظهرت أن BITC أكثر سمية بكثير من AITC و4-HBITC. لتحديد السمية، تم استخدام خمسة تركيزات من BITC (1، 3، 6، 9، و12 جزء في المليون)، وسبعة تركيزات من AITC (5، 10، 15، 20، 25، 30، و35 جزء في المليون)، وستة تركيزات من 4-HBITC (15، 15، 20، 25، 30، و35 جزء في المليون). حُقنت المعالجة الضابطة بـ 108 ميكرولتر من الإيثانول المطلق، وهو ما يعادل الحد الأقصى لحجم المعالجة الكيميائية. أُجريت الاختبارات الحيوية كما هو مذكور أعلاه، مع تعريض ما مجموعه 180 يرقة لكل تركيز معالجة. سُجلت نسبة نفوق اليرقات لكل تركيز من AITC وBITC و4-HBITC بعد 24 ساعة من التعرض المستمر.
أُجري تحليل بروبيت لبيانات 65 حالة وفاة مرتبطة بالجرعة باستخدام برنامج بولو (Polo Plus، LeOra Software، الإصدار 1.0) لحساب تركيز 50% القاتل (LC50)، وتركيز 90% القاتل (LC90)، والانحدار، ومعامل الجرعة القاتلة، وتركيز 95% القاتل. واستنادًا إلى فترات ثقة لنسب الجرعة القاتلة لتركيز اللوغاريتم المحول ومنحنيات الجرعة-الوفاة، استندت بيانات الوفيات إلى بيانات مكررة مجمعة لـ 180 يرقة تعرضت لكل تركيز علاجي. وأُجريت تحليلات احتمالية منفصلة لكل وجبة بذور وكل مكون كيميائي. واستنادًا إلى فترة ثقة 95% لنسبة الجرعة القاتلة، اعتُبرت سمية وجبة البذور والمكونات الكيميائية ليرقات البعوض مختلفة بشكل كبير، لذا فإن فترة ثقة بقيمة 1 لم تكن مختلفة بشكل كبير، P = 0.0566.
نتائج كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC) لتحديد الجلوكوزينولات الرئيسية في دقيق البذور منزوع الدهن DFP، وIG، وPG، وLs مُدرجة في الجدول 1. تباينت الجلوكوزينولات الرئيسية في دقيق البذور المُختبر، باستثناء DFP وPG، حيث احتوى كلاهما على جلوكوسينات الميروزيناز. كان محتوى الميروسينين في PG أعلى منه في DFP، حيث بلغ 33.3 ± 1.5 و26.5 ± 0.9 ملغم/غ، على التوالي. احتوى مسحوق بذور Ls على 36.6 ± 1.2 ملغم/غ من الجلوكوزغليكون، بينما احتوى مسحوق بذور IG على 38.0 ± 0.5 ملغم/غ من السينابين.
قُتلت يرقات بعوض الزاعجة المصرية (Ae. Aedes aegypti) عند معالجتها بمسحوق بذور منزوع الدهن، على الرغم من اختلاف فعالية العلاج باختلاف نوع النبات. لم يكن DFP-NT سامًا ليرقات البعوض بعد 24 و72 ساعة من التعرض (الجدول 2). ازدادت سمية مسحوق البذور النشط بزيادة التركيز (الشكل 1أ، ب). تباينت سمية مسحوق البذور ليرقات البعوض بشكل كبير بناءً على فاصل الثقة 95% لنسبة الجرعة المميتة لقيم LC50 عند تقييمات 24 و72 ساعة (الجدول 3). بعد 24 ساعة، كان التأثير السام لمسحوق بذور Ls أكبر من معالجات مسحوق البذور الأخرى، مع أعلى نشاط وأقصى سمية لليرقات (LC50 = 0.04 جم/120 مل dH2O). كانت اليرقات أقل حساسية لـ DFP عند 24 ساعة مقارنةً بمعالجات مسحوق بذور IG وLs وPG، حيث بلغت قيم LC50 0.115 و0.04 و0.08 جم/120 مل dH2O على التوالي، وهي أعلى إحصائيًا من قيمة LC50. 0.211 جم/120 مل dH2O (الجدول 3). بلغت قيم LC90 لـ DFP وIG وPG وLs 0.376 و0.275 و0.137 و0.074 جم/120 مل dH2O على التوالي (الجدول 2). بلغ أعلى تركيز لـ DPP 0.12 جم/120 مل dH2O. بعد 24 ساعة من التقييم، بلغ متوسط ​​معدل وفيات اليرقات 12% فقط، بينما بلغ متوسط ​​معدل وفيات يرقات IG وPG 51% و82% على التوالي. بعد 24 ساعة من التقييم، كان متوسط ​​معدل وفيات اليرقات لأعلى تركيز من معالجة وجبة بذور Ls (0.075 جم / 120 مل dH2O) 99٪ (الشكل 1أ).
تم تقدير منحنيات الوفيات من استجابة الجرعة (Probit) ليرقات Ae. المصرية (يرقات الطور الثالث) لتركيز وجبة البذور بعد 24 ساعة (أ) و72 ساعة (ب) من العلاج. يمثل الخط المنقط التركيز المميت لنصف الجرعة (LC50) لوجبة البذور. DFP Thlaspi arvense، DFP-HT Thlaspi arvense المعطل حراريًا، IG Sinapsis alba (Ida Gold)، PG Brassica juncea (Pacific Gold)، Ls Lepidium sativum.
بعد تقييم دام 72 ساعة، بلغت قيم LC50 لمسحوق بذور DFP وIG وPG 0.111 و0.085 و0.051 غ/120 مل من الماء، على التوالي. نفقت جميع اليرقات تقريبًا التي تعرضت لمسحوق بذور Ls بعد 72 ساعة من التعرض، لذا كانت بيانات الوفيات غير متوافقة مع تحليل Probit. بالمقارنة مع أنواع أخرى من مسحوق البذور، كانت اليرقات أقل حساسية لمعاملة مسحوق بذور DFP، وكانت قيم LC50 أعلى إحصائيًا (الجدولان 2 و3). بعد 72 ساعة، قُدِّرت قيم LC50 لمعاملات مسحوق بذور DFP وIG وPG بـ 0.111 و0.085 و0.05 غ/120 مل من الماء، على التوالي. بعد ٧٢ ساعة من التقييم، بلغت قيم LC90 لمساحيق بذور DFP وIG وPG ٠.٢١٥ و٠.٢٥٤ و٠.١٣٨ غ/١٢٠ مل من الماء، على التوالي. بعد ٧٢ ساعة من التقييم، بلغ متوسط ​​معدل نفوق اليرقات لمعاملات دقيق بذور DFP وIG وPG عند أقصى تركيز ٠.١٢ غ/١٢٠ مل من الماء، ٥٨٪ و٦٦٪ و٩٦٪ على التوالي (الشكل ١ب). بعد ٧٢ ساعة من التقييم، وُجد أن دقيق بذور PG أكثر سمية من دقيق بذور IG وDFP.
يمكن للإيزوثيوسيانات الاصطناعية، وهي إيزوثيوسيانات الأليل (AITC)، وإيزوثيوسيانات البنزيل (BITC)، و4-هيدروكسي بنزيل إيزوثيوسيانات (4-HBITC)، القضاء على يرقات البعوض بفعالية. بعد 24 ساعة من المعالجة، كان BITC أكثر سمية لليرقات، حيث بلغت قيمة LC50 5.29 جزء في المليون، مقارنةً بـ 19.35 جزء في المليون لـ AITC و55.41 جزء في المليون لـ 4-HBITC (الجدول 4). بالمقارنة مع AITC وBITC، يتميز 4-HBITC بسمية أقل وقيمة LC50 أعلى. توجد اختلافات كبيرة في سمية يرقات البعوض للإيزوثيوسياناتين الرئيسيتين (Ls وPG) في وجبة البذور الأكثر فعالية. أظهرت السمية، بناءً على نسبة الجرعة المميتة لقيم LC50 بين AITC وBITC و4-HBITC، فرقًا إحصائيًا، حيث لم تتضمن فاصلة الثقة 95% لنسبة الجرعة المميتة لـ LC50 قيمة 1 (P = 0.05، الجدول 4). وقد قُدِّر أن أعلى تركيزات لكلٍّ من BITC وAITC قتلت 100% من اليرقات المختبرة (الشكل 2).
قُدِّرت منحنيات الوفيات من استجابة الجرعة (Probit) لـ Ae. بعد 24 ساعة من العلاج، وصلت يرقات الطور الثالث المصرية إلى تركيزات إيزوثيوسيانات اصطناعية. يمثل الخط المنقط التركيز المميت النصفي (LC50) لعلاج إيزوثيوسيانات. إيزوثيوسيانات البنزيل BITC، إيزوثيوسيانات الأليل AITC، و4-HBITC.
لطالما دُرِس استخدام المبيدات الحيوية النباتية كعوامل لمكافحة نواقل البعوض. تُنتج العديد من النباتات مواد كيميائية طبيعية ذات فعالية مبيدة للحشرات37. تُوفر مركباتها الحيوية بديلاً جذابًا للمبيدات الحشرية الاصطناعية، مع إمكانات كبيرة في مكافحة الآفات، بما في ذلك البعوض.
يُزرع نبات الخردل كمحصول لبذوره، ويُستخدم كتوابل ومصدر للزيت. عند استخلاص زيت الخردل من البذور أو عند استخلاصه لاستخدامه كوقود حيوي، 69 يكون الناتج الثانوي هو دقيق بذور منزوع الدهن. يحتفظ دقيق البذور هذا بالعديد من مكوناته الكيميائية الحيوية الطبيعية وإنزيماته المُحللة. تُعزى سمية دقيق البذور هذا إلى إنتاج إيزوثيوسيانات 55،60،61. تتكون الإيزوثيوسيانات عن طريق تحلل الجلوكوزينولات بواسطة إنزيم الميروزيناز أثناء ترطيب دقيق البذور 38،55،70، ومن المعروف أن لها تأثيرات مبيدة للفطريات والبكتيريا والنيماتودا والحشرات، بالإضافة إلى خصائص أخرى تشمل التأثيرات الحسية الكيميائية وخصائص العلاج الكيميائي 61،62،70. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن نباتات الخردل ودقيق البذور يعملان بفعالية كمبيدين ضد آفات التربة والأغذية المخزنة 57،59،71،72. في هذه الدراسة، قيّمنا سمية دقيق البذور الرباعي ومنتجاته الحيوية الثلاثة AITC وBITC و4-HBITC على يرقات بعوض الزاعجة المصرية. من المتوقع أن تُنشّط إضافة دقيق البذور مباشرةً إلى الماء الذي يحتوي على يرقات البعوض عمليات إنزيمية تُنتج إيزوثيوسيانات سامة ليرقات البعوض. وقد ثبت هذا التحول الحيوي جزئيًا من خلال النشاط المبيد لليرقات الملحوظ لدقيق البذور وفقدانه للنشاط المبيد للحشرات عند معالجة دقيق بذور الخردل القزم حراريًا قبل الاستخدام. من المتوقع أن تُدمّر المعالجة الحرارية الإنزيمات المُحللة التي تُنشّط الجلوكوسينولات، مما يمنع تكوين إيزوثيوسيانات نشطة حيويًا. تُعد هذه أول دراسة تُؤكّد الخصائص المُبيدة للحشرات لمسحوق بذور الكرنب ضد البعوض في البيئات المائية.
من بين مساحيق البذور المختبرة، كان مسحوق بذور الجرجير المائي (Ls) الأكثر سمية، مسببًا ارتفاعًا في معدل نفوق بعوضة الزاعجة البيضاء. عولجت يرقات الزاعجة المصرية باستمرار لمدة 24 ساعة. أما مساحيق البذور الثلاثة المتبقية (PG وIG وDFP) فكان نشاطها أبطأ، ومع ذلك تسببت في معدل نفوق كبير بعد 72 ساعة من المعالجة المستمرة. احتوى مسحوق بذور Ls فقط على كميات كبيرة من الجلوكوزينولات، بينما احتوى PG وDFP على ميروسيناز، بينما احتوى IG على غلوكوسينولات كمصدر رئيسي للغلوكوسينولات (الجدول 1). يُحلل الجلوكوتروبايولين إلى BITC، ويُحلل السينالبين إلى 4-HBITC61،62. تشير نتائج التحليل الحيوي لدينا إلى أن كلًا من مسحوق بذور Ls وBITC الاصطناعي شديد السمية ليرقات البعوض. المكون الرئيسي لمسحوق بذور PG وDFP هو ميروسيناز غلوكوسينولات، والذي يُحلل إلى AITC. يُعدّ مُركّب AITC فعّالاً في قتل يرقات البعوض، حيث تبلغ قيمة LC50 فيه 19.35 جزء في المليون. وبالمقارنة مع مُركّبي AITC وBITC، يُعدّ إيزوثيوسيانات 4-HBITC الأقل سُميّةً لليرقات. ورغم أن AITC أقل سُميّةً من BITC، إلا أن قيم LC50 فيه أقلّ من العديد من الزيوت العطرية التي اختُبرت على يرقات البعوض32،73،74،75.
يحتوي مسحوق بذور الفصيلة الصليبية الذي نستخدمه لمكافحة يرقات البعوض على جلوكوسينولات رئيسي واحد، يُمثل ما يزيد عن 98-99% من إجمالي الجلوكوسينولات، وفقًا لتحليل كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC). وُجدت آثار من جلوكوسينولات أخرى، لكن مستوياتها كانت أقل من 0.3% من إجمالي الجلوكوسينولات. يحتوي مسحوق بذور الجرجير (L. sativum) على جلوكوسينولات ثانوية (سينيجرين)، لكن نسبتها تبلغ 1% من إجمالي الجلوكوسينولات، ولا يزال محتواها ضئيلًا (حوالي 0.4 ملغم/غرام من مسحوق البذور). على الرغم من أن PG وDFP يحتويان على نفس الجلوكوسينولات الرئيسي (ميروسين)، إلا أن النشاط القاتل لليرقات لوجبات بذورهما يختلف اختلافًا كبيرًا بسبب قيم LC50. يختلف في سميته تجاه البياض الدقيقي. قد يُعزى ظهور يرقات بعوضة الزاعجة المصرية إلى اختلافات في نشاط الميروزيناز أو استقراره بين نوعي البذور. يلعب نشاط الميروزيناز دورًا هامًا في التوافر الحيوي لنواتج التحلل المائي، مثل إيزوثيوسيانات، في نباتات الفصيلة الصليبية.76. وقد أظهرت تقارير سابقة أجراها بوكوك وآخرون.77 وويلكينسون وآخرون.78 أن التغيرات في نشاط الميروزيناز واستقراره قد ترتبط أيضًا بعوامل وراثية وبيئية.
تم حساب محتوى الإيزوثيوسيانات النشط بيولوجيًا بناءً على قيم LC50 لكل وجبة بذور عند 24 و 72 ساعة (الجدول 5) للمقارنة مع التطبيقات الكيميائية المقابلة. بعد 24 ساعة، كانت الإيزوثيوسيانات في وجبة البذور أكثر سمية من المركبات النقية. كانت قيم LC50 المحسوبة بناءً على أجزاء في المليون (ppm) من معالجات بذور الإيزوثيوسيانات أقل من قيم LC50 لتطبيقات BITC و AITC و 4-HBITC. لاحظنا أن اليرقات تستهلك حبيبات وجبة البذور (الشكل 3أ). وبالتالي، قد تتلقى اليرقات تعرضًا أكثر تركيزًا للإيزوثيوسيانات السامة عن طريق تناول حبيبات وجبة البذور. كان هذا أكثر وضوحًا في معالجات وجبة بذور IG و PG عند التعرض لمدة 24 ساعة، حيث كانت تركيزات LC50 أقل بنسبة 75٪ و 72٪ من معالجات AITC النقية و 4-HBITC على التوالي. كانت معالجات Ls وDFP أكثر سمية من الإيزوثيوسيانات النقية، حيث انخفضت قيم LC50 بنسبة 24% و41% على التوالي. تعذرت اليرقات في المعالجة الضابطة بنجاح (الشكل 3ب)، بينما لم تتعذر معظم اليرقات في المعالجة بمسحوق البذور، وتأخر نموها بشكل ملحوظ (الشكل 3ب، د). في سبودوبتيراليتورا، ترتبط الإيزوثيوسيانات بتأخر النمو والتطور79.
عُرضت يرقات بعوض الزاعجة المصرية (Ae. Aedes aegypti) باستمرار لمسحوق بذور نبات الكرنب لمدة تتراوح بين 24 و72 ساعة. (أ) يرقات ميتة مع جزيئات من دقيق البذور في أجزاء الفم (محاطة بدائرة)؛ (ب) أظهرت المعالجة الضابطة (dH2O بدون إضافة دقيق بذور) أن اليرقات تنمو بشكل طبيعي وتبدأ في التعذر بعد 72 ساعة. (ج، د) يرقات عولجت بدقيق البذور؛ أظهرت دقيق البذور اختلافات في النمو ولم تتعذر.
لم ندرس آلية التأثيرات السامة للإيزوثيوسيانات على يرقات البعوض. ومع ذلك، أظهرت دراسات سابقة على نمل النار الأحمر (Solenopsis invicta) أن تثبيط إنزيمي الجلوتاثيون إس-ترانسفيراز (GST) والإستراز (EST) هو الآلية الرئيسية للنشاط الحيوي للإيزوثيوسيانات، ويمكن لمادة AITC، حتى عند انخفاض نشاطها، أن تُثبط أيضًا نشاط GST. النمل الناري الأحمر المستورد بتركيزات منخفضة. الجرعة 0.5 ميكروغرام/مل.80. في المقابل، تُثبط مادة AITC إنزيم الأسيتيل كولينستراز في سوسة الذرة البالغة (Sitophilus zeamais).81. يجب إجراء دراسات مماثلة لتوضيح آلية نشاط الإيزوثيوسيانات في يرقات البعوض.
نستخدم معالجة DFP المعطلة حرارياً لدعم فرضية أن تحلل الجلوكوزينولات النباتية لتكوين إيزوثيوسيانات تفاعلية يعمل كآلية لمكافحة يرقات البعوض باستخدام دقيق بذور الخردل. لم يكن دقيق بذور DFP-HT ساماً عند معدلات الاستخدام المختبرة. أفاد لافارجا وآخرون 82 أن الجلوكوزينولات حساسة للتحلل في درجات الحرارة العالية. ومن المتوقع أيضاً أن تؤدي المعالجة الحرارية إلى تحلل إنزيم الميروزيناز في دقيق البذور ومنع تحلل الجلوكوزينولات لتكوين إيزوثيوسيانات تفاعلية. وقد أكد أوكوناد وآخرون ذلك أيضاً 75، حيث أظهروا أن الميروزيناز حساس لدرجة الحرارة، موضحين أن نشاط الميروزيناز قد توقف تماماً عند تعرض بذور الخردل والخردل الأسود وجذر الدم لدرجات حرارة أعلى من 80 درجة مئوية. قد تؤدي هذه الآليات إلى فقدان النشاط المبيد للحشرات لدقيق بذور DFP المعالج حرارياً.
وبالتالي، فإن دقيق بذور الخردل وثلاث إيزوثيوسيانات رئيسية منه سامة ليرقات البعوض. ونظرًا لهذه الاختلافات بين دقيق البذور والمعالجات الكيميائية، قد يكون استخدام دقيق البذور طريقة فعالة لمكافحة البعوض. وهناك حاجة إلى تحديد تركيبات مناسبة وأنظمة توصيل فعالة لتحسين فعالية واستقرار استخدام مساحيق البذور. وتشير نتائجنا إلى إمكانية استخدام دقيق بذور الخردل كبديل للمبيدات الحشرية الاصطناعية. ويمكن أن تصبح هذه التقنية أداة مبتكرة لمكافحة نواقل البعوض. ونظرًا لأن يرقات البعوض تزدهر في البيئات المائية، ولأن جلوكوسينولات دقيق البذور تتحول إنزيميًا إلى إيزوثيوسيانات نشطة عند الترطيب، فإن استخدام دقيق بذور الخردل في المياه الموبوءة بالبعوض يوفر إمكانات كبيرة لمكافحة البعوض. وعلى الرغم من أن النشاط القاتل لليرقات للإيزوثيوسيانات يختلف (BITC > AITC > 4-HBITC)، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد ما إذا كان الجمع بين دقيق البذور مع العديد من الجلوكوسينولات يزيد من السمية بشكل تآزري. هذه أول دراسة تُبيّن التأثيرات المُبيدة لمسحوق بذور الفصيلة الصليبية منزوعة الدهن وثلاثة إيزوثيوسيانات نشطة بيولوجيًا على البعوض. تُمثّل نتائج هذه الدراسة نقلةً نوعيةً بإظهارها أن مسحوق بذور الملفوف منزوع الدهن، وهو مُنتج ثانوي لاستخلاص الزيت من البذور، قد يُمثّل عاملًا واعدًا لإبادة اليرقات في مكافحة البعوض. يُمكن أن تُساعد هذه المعلومات في تعزيز اكتشاف عوامل المكافحة الحيوية النباتية وتطويرها كمبيدات حيوية رخيصة وعملية وصديقة للبيئة.
تتوفر مجموعات البيانات المُنتجة لهذه الدراسة والتحليلات الناتجة عنها لدى المؤلف المُراسل بناءً على طلب معقول. في نهاية الدراسة، تم إتلاف جميع المواد المُستخدمة فيها (الحشرات ومسحوق البذور).